阿米福汀對(duì)急性髓性白血病化療藥物安丫啶敏感性的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究人端粒酶抑制劑阿米福汀(amifostine)對(duì)急性髓性細(xì)胞白血病細(xì)胞株--U-937細(xì)胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(hTERT)表達(dá)水平的影響；對(duì)化療藥物安丫啶(Amsacrine)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。同時(shí)進(jìn)一步比較單用Amsacrine與聯(lián)合amifostine的作用效果，探討低劑量Amsacrine與高劑量amifostine聯(lián)用后，對(duì)U-937細(xì)胞的作用效果和作用機(jī)制。 方法：將受試對(duì)象分為9組

2、：設(shè)正常對(duì)照組、及加藥實(shí)驗(yàn)組Amsacrine(30μmol/L、100μmol/L)、Amifostine(10<'3>μmol/L、10<'4>μmol/L)、以及Amsacrine+Amifostine 3μmol/L+10<'3>μmol/L、3μmol/L+10<'4>μmol/L、10μmol/L+10<'3>μmol/L、10μmol/L+10<'4>μmol/L，作用時(shí)間分為3個(gè)水平：24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，檢測(cè)相

3、關(guān)的指標(biāo)變化： (1)應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)U-937細(xì)胞的增殖活性； (2)應(yīng)用姬姆薩(Giemsa)染色法觀察細(xì)胞形態(tài)； (3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)hTERTmRNA表達(dá)水平變化； (4)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期。 結(jié)果： (1)MTT比色法提示：3μmol/L、10μmol/LAmsacrine作用U-937細(xì)胞株后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，隨著作用

4、時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率依次增加，且具有明顯的量效關(guān)系(P<0.05)。Amifostine單藥組(10<'3>μmol/L、10<'4>μmol/L)對(duì)U-937細(xì)胞在各個(gè)時(shí)點(diǎn)(24 h，48 h，72h)均有抑制作用，以其10<'4>μmol/L作用72h為抑制高峰(P<0.05)兩藥聯(lián)用組對(duì)U-937細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，在24小時(shí)與相同劑量Amsacrine單用組相比較，具有輕度的細(xì)胞抑制作用(P<0.05)；48小時(shí)后，兩藥聯(lián)用組對(duì)細(xì)

5、胞的活性產(chǎn)生明顯的抑制作用，強(qiáng)于相同劑量的Amsacrine單用組(P<0.05)，且隨時(shí)間的增加其抑制作用逐步增強(qiáng)，以Amsacrine3μmol/L+ Amifostine10<'4>μmol/L作用72小時(shí)后抑制作用最明顯(P<0.05)，顯著強(qiáng)于Amsacrine10μmol/L單用組(P<0.05)。 (2)姬姆薩(Giemsa)染色法觀察細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞外形迅速皺縮，體積明顯減小；核皺縮，染色質(zhì)凝聚成致密團(tuán)塊

6、，隨之細(xì)胞核碎裂成小的圓形致密團(tuán)塊，散布與胞質(zhì)中；晚期產(chǎn)生的細(xì)胞碎片呈簇狀分布于細(xì)胞周圍。Amsacrine 3u mol/L或10 u mol/L作用于U937細(xì)胞，24、48小時(shí)光鏡下見到少量凋亡細(xì)胞：anlifostine與Amsacrine聯(lián)合應(yīng)用72小時(shí)觀察凋亡細(xì)胞明顯增加。凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)為，細(xì)胞縮小，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝聚，核固縮并斷裂成數(shù)個(gè)大小不等的圓形顆粒，并釋放到細(xì)胞外，形成凋亡小體。 (3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(

7、RT-PCR)發(fā)現(xiàn)Amsacrine或Amifostine單獨(dú)作用于U-937細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，劑量的增加，hTERTmRNA的表達(dá)逐漸降低，在72小時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，與24、48小時(shí)相比具有顯著差異性(P<0.05)。 在24小時(shí)聯(lián)合藥物組，與U-937細(xì)胞初始表達(dá)量相比，hTERTmRNA的表達(dá)開始降低，具有顯著差異性(P<0.05)。與24小時(shí)相比，48小時(shí)聯(lián)合藥物組中hTERTmRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

8、72小時(shí)聯(lián)合藥物組hTERTmRNA的表達(dá)量達(dá)到最低。 Amsacrine低劑量組3μmol/L聯(lián)合Amifostine高劑量組10<'4>μmol/L與單用高劑量Amsacrine10μmol/L相比，24小時(shí)具有輕度的細(xì)胞抑制作用(P<0.05)；48小時(shí)Amsacrine 3μmol/L+Amifostine 10<'4>μmol/L聯(lián)合組可顯著降低U-937細(xì)胞hTERTmRNA的表達(dá)；在72小時(shí)Amsacrine 3μ

9、mol/L+Amifostine 10<'4>μmol/L聯(lián)合組的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于相同時(shí)間段的單用高劑量組(P<0.05)。 (4)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示Amsacrine或Amifostine單獨(dú)作用于U-937細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，劑量的增加，S期和G<,2>/M期的細(xì)胞的比例逐漸降低，在72小時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，與24、48小時(shí)相比具有顯著差異性。而G<,0>/G<,1>期細(xì)胞的比例卻隨著藥物劑量的增加，時(shí)間的延

10、長(zhǎng)而逐漸增高。 在24小時(shí)聯(lián)合藥物組，與U-937細(xì)胞對(duì)照組S期和G<,2>期百分比相比，S期和G<,2>期百分比開始降低，具有顯著差異性(P<0.05)。與24小時(shí)相比，48小時(shí)聯(lián)合藥物組中S期和G<,2>期百分比明顯降低(P<0.05)。72小時(shí)聯(lián)合藥物組S期和G<,2>期百分比的表達(dá)量達(dá)到最低。其中Amsacrine低劑量組3μmol/L聯(lián)合Amifostine高劑量組10<'4>μmol/L作用最明顯。 Amsa

11、crine低劑量組3μmol/L聯(lián)合Amifostine高劑量組10<'4>μmol/L與單用高劑量Amsacrine10μmol/L相比，24小時(shí)具有輕度的細(xì)胞抑制作用(P<0.05)；48小時(shí)Amsacrine 3μmol/L+Amifostine 10<'4>μamol/L聯(lián)合組可顯著降低U-937細(xì)胞S期和G<,2>期百分比；在72小時(shí)Amsacrine 3μmol/L+Amifostine 10<'4>μmol/L聯(lián)合組的抑制

12、效應(yīng)明顯強(qiáng)于相同時(shí)間段的單用高劑量組(P<0.05)。 結(jié)論： 1.amifostine能抑制急性髓性細(xì)胞白血病細(xì)胞株--U-937細(xì)胞hTERTmRNA的表達(dá)水平，對(duì)腫瘤細(xì)胞無保護(hù)作用； 2.hTERTmRNA表達(dá)受到抑制后，amifostine增強(qiáng)了Amsacrine誘導(dǎo)U-937細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)使細(xì)胞周期發(fā)生顯著變化，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞數(shù)增多，S期及G<,2>/M期細(xì)胞數(shù)則減少。 3.

13、當(dāng)Amsacrine低劑量組3μmol/L聯(lián)合Amifostine高劑量組10<'4>μmol/L作用于U937細(xì)胞后，明顯降低hTERTmRNA同時(shí)其S期和G<,2>/M期細(xì)胞比例逐漸下降，在72小時(shí)達(dá)到最低。與相關(guān)的單用高劑量Amsacrine組相比，其細(xì)胞阻滯作用十分明顯，甚至強(qiáng)于高劑量Amsacrine 10μmol/L聯(lián)合amifostine高劑量組10<'4>μmol/L增加了白血病細(xì)胞對(duì)Amsacrine的敏感性。Amif