TET2基因轉(zhuǎn)染對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞生長及17-DMAG治療敏感性的影響及機(jī)制.pdf

1、本研究通過三部分研究了TET2基因轉(zhuǎn)染對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞生長及17-DMAG治療敏感性的影響及機(jī)制。第一部分我們通過回顧性分析184例急性髓系白血病患者標(biāo)本TET2突變情況，并研究患者的臨床特征、化療敏感度、生存時(shí)間等，從而為AML預(yù)后分層提供一定的參考意義。第二部分通過體外培養(yǎng)人白血病細(xì)胞HL-60，檢測(cè)17-DMAG對(duì)人白血病細(xì)胞增殖及凋亡的影響以及可能的機(jī)制。第三部分我們使用17-DMAG作用于TET2基因轉(zhuǎn)載的HL-60細(xì)胞，

2、從而明確17-DMAG與TET2在急性白血病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系及機(jī)制
　　第一部分：探討TET2基因和TET2基因突變?cè)诩毙运柘蛋籽≈械谋磉_(dá)及其臨床意義
　　目的：分析初診急性髓系白血病TET2基因突變發(fā)生率，評(píng)價(jià)TET2突變型及TET2野生型患者臨床特征、近期療效及遠(yuǎn)期預(yù)后。
　　方法：回顧性分析184例初治急性髓系白血病患者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)TET2基因表達(dá)及突變，并通過直接測(cè)序的方法檢測(cè)TET2與

3、NPM1、DNMT3a、FLT3-ITD、CEBPA的突變狀態(tài)，同時(shí)收集患者臨床資料。誘導(dǎo)治療主要采用標(biāo)準(zhǔn)劑量的 DA、IA或地西他濱+CAG方案。比較TET2基因突變和TET2野生型患者之間臨床資料的異同，評(píng)價(jià)TET2突變患者化療療效，及分析該基因突變表達(dá)水平與野生型患者之間的總生存率和無事件生存率的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　184例初發(fā)急性髓細(xì)胞白血病患者（非M3）標(biāo)本中檢測(cè)出32例發(fā)生TET2基因突變，發(fā)生率為17.39

4、%；32例TET2基因突變患者組中男26例，女6例，中位年齡44歲（18–68歲）；152例陰性患者組中男110例，女42例，中位年齡38.5歲(18～87歲)。兩組年齡及性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與TET2野生型患者相比，TET2突變患者具有以下臨床特征：初診時(shí)患者類型多為M4、M5亞型，外周血血小板較低(P=0.04)；易合并DNMT3a、FLT3-ITD、CEBPA突變，（P<0.05）。但在FAB亞型，外周血白血病，血紅

5、蛋白、骨髓原始細(xì)胞百分比、伴 NPM1基因突變、NCCN預(yù)后危險(xiǎn)分組方面，兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　TET2野生型152例AML患者治療完全緩解86例(86/152，56.58％)，部分緩解9例（9/152，5.92％），未緩解48例(48/152，31.58％)；TET2突變組32例AML患者治療完全緩解20例(20/32，62.5％)，部分緩解4例（4/32，12.5％），未緩解8例(8/32，25％)；三組差別

6、均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.37)。
　　184例患者隨訪12-60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間30個(gè)月。TET2突變組患者無病生存期（DFS）和總生存期（OS）明顯短于TET2野生型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯差異（P<0.05）
　　結(jié)論：TET2基因在中國AML患者中的突變率與西方人群相似，TET2基因突變與AML特定生物學(xué)特征相關(guān)，突變患者其整體生存期及無病生存期明顯縮短，提示該突變對(duì)成人患者的危險(xiǎn)分級(jí)和治療具有重要的意義。
　　第二部

7、分：17-DMAG抑制白血病細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡
　　目的：觀察17-DMAG對(duì)白血病細(xì)胞增殖及凋亡的影響方法：
　　1.使用MTT法及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度、不同作用時(shí)間17-DMAG對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響。
　　2.使用Annexin V/PI染色及合并流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度17-DMAG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞凋亡的情況。
　　3.使用JC-1染色流式法檢測(cè)17-DMAG對(duì)HL-6

8、0細(xì)胞線粒體膜電位的影響。
　　4.使用Western blot檢測(cè)17-DMAG作用白血病細(xì)胞HL-60后caspase-3、caspase-9、Bcl、Bax的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，從而研究17-DMAG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60凋亡的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示17-DMAG對(duì)于白血病細(xì)胞株HL-60生長具有抑制作用，MTT法顯示17-DMAG抑制白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞增殖呈時(shí)間和劑量依

9、賴性。
　　2.Annexin V/PI染色合并流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)17-DMAG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：17-DMAG呈時(shí)間和劑量依賴的誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞調(diào)亡。
　　3.17-DMAG處理HL-60細(xì)胞48 h后隨著17-DMAG濃度的增加紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸加強(qiáng)，JC-1染色結(jié)果表明17-DMAG可降低白血病細(xì)胞HL-60線粒體膜電位。
　　4.17-DMAG處理48 h，促凋亡Bax，c-

10、caspase-3和c-caspase-9的蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）上調(diào)，抗凋亡的存活蛋白survivin和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著（P<0.01）下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.17-DMAG能夠抑制 HL-60細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度的增加、作用時(shí)間的延長，細(xì)胞生長抑制率有逐漸增加的趨勢(shì)，證實(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性。
　　2.17-DMAG能夠誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞凋亡。
　　

11、3.17-DMAG誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可能是通過凋亡線粒體途徑作用，與增加 caspase-9和 caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào) Bcl-2和上調(diào) Bax蛋白表達(dá)水平有關(guān)。
　　第三部分：TET2基因能增強(qiáng)17-DMAG對(duì)人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株凋亡及對(duì)信號(hào)通路PI3k/AKT信號(hào)通路影響研究
　　目的：研究轉(zhuǎn)染TET2基因過表達(dá)對(duì)于急性急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株增殖及凋亡的影響。探討TET2基因聯(lián)

12、合17-DMAG對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖及凋亡的作用及對(duì)信號(hào)通路PI3K/AKT影響，進(jìn)而為急性髓系白血病白血病的治療探索新思路。
　　方法：
　　1.將過表達(dá)TET2慢病毒載體pWPT-PURO-TET2轉(zhuǎn)染至白血病HL-60細(xì)胞株，以提高白血病HL-60細(xì)胞系TET2的表達(dá)。為了分析重組慢病毒載體是否成功的轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，在感染后第3天通過熒光顯微鏡觀察是否有GFP+的HL-60細(xì)胞及陽性細(xì)胞的比例，并用We

13、stern blot法檢測(cè)TET2蛋白的表達(dá)情況。
　　2.通過MTT法檢測(cè)白血病細(xì)胞 HL-60轉(zhuǎn)染TET2前后細(xì)胞生長曲線變化。
　　3.使用Annexin V/PI雙染的方法通過流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染前后白血病細(xì)胞的凋亡情況。
　　4.MTT法檢測(cè)17-DMAG藥物作用于TET2轉(zhuǎn)染后白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞增殖及抑制的作用。
　　5.使用Annexin V/PI染色合并流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TET2過表達(dá)增強(qiáng)白血病

14、HL-60細(xì)胞對(duì)17-DMAG的治療敏感性。
　　6.使用western blot方法檢測(cè)17-DMAG對(duì)TET2轉(zhuǎn)染后白血病細(xì)胞株HL-60 PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡檢查顯示慢病毒pWPT-PURO-GFP-TET2轉(zhuǎn)染的人白血病HL-60細(xì)胞系，超過80％的細(xì)胞是GFP+。Western blot法檢測(cè)TET2蛋白的表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TET2質(zhì)粒的白血病HL-6

15、0細(xì)胞系TET2蛋白表達(dá)遠(yuǎn)大于空載體轉(zhuǎn)染組。
　　2.MTT法結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組較轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞生長明顯減慢（P<0.05）。
　　3.使用Annexin V/PI雙染的方法通過流式細(xì)胞儀測(cè)定白血病細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：
　　轉(zhuǎn)染過表達(dá)TET2載體的白血病HL-60細(xì)胞系凋亡明顯增加（P<0.05）。
　　4.17-DMAG作用于轉(zhuǎn)染過表達(dá)TET2載體的白血病HL-60細(xì)胞后，MTT法結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 TET2基因，或是加

16、入1.6μmol·L17-DMAG，都能夠明顯抑制 HL-60細(xì)胞增殖率，尤以轉(zhuǎn)染 TET2聯(lián)合17-DMAG對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)。
　　5.Western blot檢測(cè)表明17-DMAG作用于轉(zhuǎn)染過表達(dá)TET2的HL-60細(xì)胞后，TET2蛋白在白血病細(xì)胞HL-60中表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示TET2基因過表達(dá)可以增強(qiáng)17-DMAG誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞

17、凋亡。
　　7.17-DMAG通過抑制PI-3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)HL-60白血病細(xì)胞凋亡，主要是通過信號(hào)通路中Bax、caspase-3、caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2、survivin表達(dá)下降實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1.TET2過表達(dá)可以引起白血病細(xì)胞HL-60生長減慢，凋亡增多，可能為白血病的一種抑癌基因。
　　2.TET2能協(xié)同17-DMAG促進(jìn)HL-60細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖。