兒童急性髓系白血病干細(xì)胞的測(cè)定及其臨床意義.pdf

1、背景：急性髓系白血病(AML)是兒童常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。隨著對(duì)白血病研究的不斷深入和新藥的開(kāi)發(fā)、利用,以蒽環(huán)類(lèi)抗生素聯(lián)合阿糖胞苷為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案使AML的治療效果有了顯著提高,但耐藥和復(fù)發(fā)依然是影響患者最終治療效果的重要障礙,其原因是常規(guī)的化療藥物不能將白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSC)完全清除。LSC是存在于白血病患者體內(nèi)由一群異質(zhì)性細(xì)胞組成的一個(gè)極微量的細(xì)胞亞群,約占白血病細(xì)胞總數(shù)的0.1～1

2、.0％。研究表明,無(wú)論是在體外長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)還是在動(dòng)物模型體內(nèi),LSC都是唯一能引起并維持白血病的細(xì)胞群。LSC具有與正常造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)類(lèi)似的生物學(xué)特性,如:具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化能力以及細(xì)胞表面類(lèi)似的抗原表達(dá)包括CD34+,CD38-,HLA-DR-,CD71-等,但在正常HSC表面表達(dá)的CD117,CD90和CD116(GM-CSF Rα)在LSC表面沒(méi)有表達(dá)。CD1

3、23僅在AML LSC表面表達(dá),在正常HSC表面不表達(dá)?，F(xiàn)已公認(rèn)正常HSC的免疫表型為CD34+/CD38-/CD123-,AML LSC的免疫表型為CD34+/CD38-/CD123+。在非AML病例中所測(cè)到的“AML LSC(CD34+/CD38-/CD123+)”我們將其定義為“AML LSC相同表型細(xì)胞”(AML LSC immunophenotype-identical cells,簡(jiǎn)稱AML LSC-IPIC)。白血病微小殘

4、留病(minimal residual diseases,MRD)是指白血病患者緩解后,在骨髓中仍存在形態(tài)學(xué)上難以檢測(cè)到的白血病細(xì)胞。白血病MRD的定量檢測(cè)對(duì)ALL患者預(yù)后意義很大,對(duì)AML患者預(yù)后意義各家報(bào)道不一,且尚未闡明MRD水平與LSC含量之間存在何種關(guān)系。有關(guān)兒童AML LSC含量的測(cè)定及AML患兒緩解后LSC含量與MRD之間關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用FCM和直接免疫熒光法標(biāo)記細(xì)胞,測(cè)定AML LSC或AML LSC

5、-IPIC在兒童急性白血病患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell,MNC)中的含量,研究AML患兒緩解后LSC含量與MRD水平之間的關(guān)聯(lián),為指導(dǎo)臨床合理治療AML提供新的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。
　　研究對(duì)象與方法：
　　1、研究對(duì)象從2007年7月到2008年2月來(lái)我院的白血病患兒113例次,男:女=2.1:1,中位年齡7.0歲(范圍2～15歲),以非腫瘤患兒為陰性對(duì)照,共12例,包括特發(fā)性血小板減少性紫癜8例,再生障礙性

6、貧血3例,傳染性單核細(xì)胞增多癥1例,男:女=1:1,中位年齡5.5歲(范圍1～12歲)。所有標(biāo)本均在采集后4個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。
　　2、研究方法
　　2.1、骨髓MNC分離及單細(xì)胞懸液制備:采用淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)常規(guī)離心分離MNC并計(jì)數(shù),用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10～7/ml,制成單細(xì)胞懸液。
　　2.2、MNC染色:取四支流式專用試管,每管分別加入10～6個(gè)細(xì)胞及1ml滅活人AB血漿,孵育10min以

7、阻斷細(xì)胞表面Fc受體,PBS洗滌后加入單抗,APC標(biāo)記試劑加5μl,PE、PerCP標(biāo)記試劑各20μl,以PE-IgG1、PerCP-IgG1和APC-IgG1作為陰性對(duì)照,避光孵育、溶血、洗滌后上流式細(xì)胞儀(FACScalibur,FCM,美國(guó)Becton Dickinson公司)測(cè)定。
　　2.3、AML LSC的測(cè)定:采用Cellquest軟件獲取100000個(gè)細(xì)胞,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行AML LSC或AML LSC-IP

8、IC分析。
　　2.4、MRD的測(cè)定:根據(jù)初診免疫表型獲得白血病相關(guān)表型(LAIP),并采用該LAIP進(jìn)行單抗組合和FCM測(cè)定分析。
　　結(jié)果：
　　1、初診白血病患兒骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC的含量11例初診AML患兒骨髓MNC中AML LSC的中位含量為166(范圍14～1459)/10萬(wàn)個(gè),12例初診ALL患兒和12例非腫瘤對(duì)照組患兒骨髓MNC中AML LSC-IPIC的中位含量分別為7

9、(范圍0～560)/10萬(wàn)個(gè)和0(范圍0～6)/10萬(wàn)個(gè)。初診AML組骨髓MNC中AML LSC含量明顯高于初診ALL組和非腫瘤對(duì)照組(P均<0.017),初診ALL組與非腫瘤對(duì)照組骨髓MNC中AML LSC-IPIC含量的差異具有顯著性(P<0.017)。
　　2、緩解期白血病患兒骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC的含量39例次緩解AML患兒骨髓MNC中AML LSC的中位含量為6(范圍0～41)/10萬(wàn)個(gè),4

10、4例次緩解ALL患兒和12例非腫瘤對(duì)照組患兒骨髓MNC中AML LSC-IPIC的中位含量分別為10(范圍0～105)/10萬(wàn)個(gè)和0(范圍0～6)/10萬(wàn)個(gè)。緩解AML組與緩解ALL組患兒骨髓MNC中AML LSC與AML LSC-IPIC含量差異無(wú)顯著性(P>0.017),但緩解AML、ALL組患兒骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC含量均明顯高于非腫瘤對(duì)照組(P均<0.017)。
　　3、AML患兒不同時(shí)期骨髓

11、MNC中AML LSC的含量11例初診AML、7例次未緩解AML、39例次緩解AML及12例非腫瘤對(duì)照組患兒骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC的中位含量分別為166(范圍14～1459)/10萬(wàn)個(gè)、36(范圍5～224)/10萬(wàn)個(gè)、6(范圍0～41)/10萬(wàn)個(gè)和0(范圍0～6)/10萬(wàn)個(gè)。初診AML組與未緩解AML組患兒骨髓MNC中AML LSC含量差異無(wú)顯著性(P>0.008);與初診AML組相比,緩解AML組患兒骨

12、髓MNC中AML LSC含量明顯降低(P<0.008),但還是顯著高于非腫瘤對(duì)照組(P<0.008)。
　　4、ALL患兒骨髓MNC中AML LSC-IPIC的含量12例初診ALL、44例次緩解ALL及12例對(duì)照祖患兒骨髓MNC中AML LSC-IPIC的中位含量分別為7(范圍0～560)/10萬(wàn)個(gè)、10(范圍0～105)/10萬(wàn)個(gè)和0(范圍0～6)/10萬(wàn)個(gè)。初診、緩解ALL組骨髓MNC中AML LSC-IPIC含量的差異無(wú)顯著

13、性(P>0.017),但均高于非腫瘤對(duì)照組(P均<0.017)。
　　5、AML患兒緩解后骨髓MNC中AML LSC含量與MRD水平的相關(guān)性對(duì)同時(shí)進(jìn)行AML LSC和MRD檢測(cè)的33例次緩解AML病例中AML LSC含量和MRD水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),兩者存在顯著負(fù)相關(guān)性(R=-0.466,P=0.006)。
　　結(jié)論：
　　1、AML LSC存在于初診AML患兒骨髓細(xì)胞中,其含量明顯高于初診ALL和非腫瘤對(duì)照組;化療