HGF-c-Met在血管損傷修復(fù)中促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖機(jī)制及歸巢作用的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 血管內(nèi)皮受損是粥樣硬化斑塊形成的始動(dòng)因素,也是血管損傷后不良修復(fù)反應(yīng)的主要原因之一。長(zhǎng)期以來(lái),傳統(tǒng)觀念認(rèn)為血管內(nèi)膜損傷后內(nèi)皮修復(fù)只有依靠損傷血管內(nèi)膜邊緣的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)參與再生。近年來(lái),實(shí)踐證明鄰近參與再生的Ecs喪失再生能力或修復(fù)的范圍有限,雖其遠(yuǎn)端細(xì)胞具有復(fù)制能力,但鄰近局部?jī)?nèi)皮增生、遷移形成的再生內(nèi)皮還會(huì)存在表型改變、功能不足或紊亂而不能發(fā)揮正常內(nèi)皮功能,也難到達(dá)

2、損傷位置而不能完成損傷血管內(nèi)膜的修復(fù)。
　　 細(xì)胞移植治療近年來(lái)已成為治療多種疾病的新策略,其目的是替代、修復(fù)或加強(qiáng)受損組織或器官的生物學(xué)功能。循環(huán)、骨髓及脾臟來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitor cell,EPC)被認(rèn)為在血管損傷后的內(nèi)皮修復(fù)中起到了越來(lái)越重要的作用。并且,研究發(fā)現(xiàn)EPCs易于在體外被基因修飾后再進(jìn)行移植,這使得EPCs成為血管損傷后一種理想的治療手段。但是,盡管目前研究證實(shí)機(jī)體自身動(dòng)員

3、的EPCs能夠參與內(nèi)皮功能不全及血管損傷的修復(fù),但并不能完全修復(fù)損傷血管并阻止過(guò)度新生內(nèi)膜形成及血管不良重構(gòu)的發(fā)生。其認(rèn)為一方面是機(jī)體自身動(dòng)員不足、自身來(lái)源的EPCs具有不同程度的功能不全;另一方面是循環(huán)中EPCs不能充分的優(yōu)勢(shì)分布并粘附至血管靶部位。因此深入了解EPCs的調(diào)節(jié)機(jī)制,找到促進(jìn)移植的EPCs向損傷血管優(yōu)勢(shì)分布的措施將會(huì)很大程度的提高修復(fù)血管損傷的療效。
　　 EPCs的功能能夠被許多生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié),其中包括血管內(nèi)皮細(xì)

4、胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelial cell growth factor,VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(firoblast growth factor,FGF)、雌激素(estrogen,ESG)等。新近,HGF對(duì)EPCs的調(diào)節(jié)逐漸引起重視。HGF被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)人類(lèi)CD34+造血干細(xì)胞的增殖與生存,在肺部受到損傷后能夠從骨髓動(dòng)員EPCs至受損傷

5、的局部。在高血壓、急性心肌梗塞、糖尿病并發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥、外周血管阻塞性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化的病人血清中,HGF的濃度是升高的。并且,有許多證據(jù)表明,在血管損傷局部有HGF的表達(dá),對(duì)促進(jìn)局部?jī)?nèi)皮修復(fù)有重要的作用。
　　 HGF促進(jìn)細(xì)胞增殖主要是通過(guò)與其特異性的由原癌基因編碼的受體c-Met相結(jié)合后開(kāi)始的。HGF與其受體結(jié)合后,磷脂酶C-γ(phosphatidase c-γ,PLC-γ)被磷酸化,磷酸化的PLC-γ引起了三磷酸肌醇(i

6、nositol triphosphate,IP3)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endocytoplasmic reticulum,ER)鈣庫(kù)耗竭和接下來(lái)的細(xì)胞外鈣離子通過(guò)細(xì)胞膜的內(nèi)流。ER鈣庫(kù)耗竭引起的細(xì)胞膜鈣離子內(nèi)流通道被稱為鈣庫(kù)操作性鈣通道(store-operatedCa2+ channels,SOCCs)。在許多非興奮性細(xì)胞,SOCCs被認(rèn)為是廣泛存在的調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的機(jī)制。Ca2+在細(xì)胞內(nèi)充當(dāng)?shù)诙攀沟淖饔?參與細(xì)胞增殖、生存、分化、運(yùn)動(dòng)等

7、多種功能。SOCCs的激活依賴于鈣池的耗竭,因此ER必須把鈣庫(kù)耗竭的信息傳遞給細(xì)胞膜上的鈣通道。一種名為間質(zhì)交感分子1(stromal interaction molecule1,STIM1)的跨膜蛋白被認(rèn)為是激活SOCCs的重要分子。STIM1被認(rèn)為是ER上鈣庫(kù)容量的感受器,細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)分布于ER膜表面,鈣離子的耗竭導(dǎo)致了STIM1構(gòu)象迅速發(fā)生改變并聚集到細(xì)胞膜附近。這種重新分布被認(rèn)為起到了信號(hào)傳遞作用,將ER上鈣離子耗竭的信號(hào)傳

8、遞給了細(xì)胞膜上的鈣離子通道,導(dǎo)致鈣離子通道的開(kāi)放。在HGF對(duì)EPCs的增殖調(diào)控中,STIM1及SOCCs是否參與其中,調(diào)控機(jī)制如何,目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)深入研究。
　　 另外,國(guó)外及我們的研究證實(shí)靜脈輸注的EPCs能夠優(yōu)勢(shì)分布至血管損傷部位參與損傷血管修復(fù),但移植的EPCs定向優(yōu)勢(shì)分布的機(jī)制仍不清楚。一般認(rèn)為,損傷局部的微環(huán)境和移植干細(xì)胞之間的相互作用促使移植的干細(xì)胞向損傷血管定向優(yōu)勢(shì)分布。損傷局部上調(diào)表達(dá)的炎性因子可能起到一定作用。

9、除炎性因子外,其他一些相對(duì)特異的因子如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor1,SDF-1)也發(fā)揮一定作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),HGF也能介導(dǎo)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分布,在血管損傷局部存在HGF表達(dá)。因此,我們有理由推測(cè)HGF/c-Met能夠通過(guò)趨化作用介導(dǎo)EPCs的優(yōu)勢(shì)分布,且局部的HGF能夠促進(jìn)移植的EPCs存活,提高細(xì)胞移植的效果。
　　 本課題通過(guò):1、用RNA干擾STIM1的方法,研究了STIM1在HG

10、F誘導(dǎo)的EPCs增殖效應(yīng)中的作用。2、構(gòu)建c-Met的腺病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染至EPCs,使之高表達(dá)c-Met,通過(guò)靜脈將之輸注大鼠體內(nèi)。利用血管損傷部位含有HGF的特點(diǎn),以期達(dá)到其促進(jìn)EPCs在移植體內(nèi)存活并通過(guò)HGF/c-Met介導(dǎo)其向血管損傷部位優(yōu)勢(shì)分布的目的。從而為豐富干細(xì)胞研究的理論、進(jìn)一步認(rèn)識(shí)血管損傷修復(fù)機(jī)制及探索修復(fù)血管損傷的有效方法提供幫助。
　　 2.方法:
　　 2.1 EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

11、　　 密度梯度離心法獲取大鼠骨髓及脾臟單個(gè)核細(xì)胞,在添加VEGF的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng),顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)學(xué)變化;UEA-I結(jié)合和DiI-LDL攝取實(shí)驗(yàn)觀察EPCs是否具有內(nèi)皮細(xì)胞功能特性;CD34、CD133、VEGFR-2流式鑒定是否具有內(nèi)皮祖細(xì)胞表型。
　　 2.2觀察HGF對(duì)EPCs增殖功能的影響
　　 胰酶消化EPCs后,接種至96孔板(1×105 cells/mL),EPCs經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)同步化后

12、,用四唑鹽比色法(MTT)測(cè)定EPCs增殖變化。
　　 2.3 RNA提取與半定量及實(shí)時(shí)定量PCR
　　 用Trlzol試劑盒提取總RNA,根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑合說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄CDNA。ABI PRISM7000軟件及熒光染料PCR法行定量PCR檢測(cè)。
　　 2.4 Westernblot檢測(cè)STIM1蛋白表達(dá)。
　　 2.5激光共聚焦檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度變化。2.6 STIM1的RNA干擾

13、載體由本實(shí)驗(yàn)室郭瑞威博士提供。2.7重組腺病毒Ad-c-Met的構(gòu)建
　　 從美國(guó)ATCC購(gòu)得目的基因c-Met片段,由北京寶賽生物公司通過(guò)同源重組系統(tǒng)構(gòu)建c-Met的病毒過(guò)表達(dá)載體。
　　 2.8觀察c-Met在血管損傷修復(fù)過(guò)程中的作用用1-2月齡的SD大鼠復(fù)制頸動(dòng)脈球囊損傷模型,然后從尾靜脈注入轉(zhuǎn)染了c-Met的EPCs。觀察過(guò)表達(dá)c-Met對(duì)損傷后第10天血管再內(nèi)皮化以及第21天新生內(nèi)膜增厚的影響。
　　

14、3.結(jié)果:
　　 3.1 EPCs分離、培養(yǎng)、鑒定:相差顯微鏡下可見(jiàn)分離后單個(gè)核細(xì)胞呈圓形懸浮于培養(yǎng)基中,胞體透亮,折光性好;細(xì)胞培養(yǎng)5d,可以觀察到細(xì)胞增多增大并伸展呈橢圓形、短梭型細(xì)胞,有少量細(xì)胞突起,集落形成較多表明細(xì)胞增殖旺盛,有時(shí)可見(jiàn)到內(nèi)皮祖細(xì)胞首尾相連,呈線狀排列;培養(yǎng)7-10d,長(zhǎng)梭型細(xì)胞較前明顯增多,并呈簇狀生長(zhǎng),有一定方向性,形成細(xì)胞團(tuán),簇狀細(xì)胞中央細(xì)胞呈圓形,外周呈放射狀;培養(yǎng)14d,有些培養(yǎng)瓶中可看到細(xì)胞首

15、尾相連,具有成網(wǎng)狀血管樣趨勢(shì)生長(zhǎng);繼續(xù)培養(yǎng)至21d,細(xì)胞相互融合呈鋪路石狀,用acLDL-Dil和FITC-UEA-1對(duì)細(xì)胞染色后,通過(guò)熒光倒置顯微鏡鑒定,FITC-UEA-1結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,acLDL-Dil攝取陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光,UEA-1和DiLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光,這些雙染的細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。利用細(xì)胞流式分析技術(shù)(FACS)分別檢測(cè)CD133、CD34、VEFGR-2在分離培養(yǎng)7d左右細(xì)胞表面

16、的表達(dá),我們觀察到CD133、CD34及VEGFR-2在培養(yǎng)細(xì)胞中的陽(yáng)性率分別為85.28％、70.49％和96.68％。
　　 3.2 HGF對(duì)EPCs增殖能力的影響
　　 3.3:HGF刺激EPCs引起了經(jīng)SOCCs的鈣離子內(nèi)流增加
　　 3.4 SOCE對(duì)HGF誘導(dǎo)的EPC增殖能力的影響。
　　 3.5 HGF作用于:EPCs引起了STIM1表達(dá)的上調(diào)。
　　 3.6 RNA干擾后STIM1

17、表達(dá)后抑制了SOCE及HGF誘導(dǎo)的EPCs的增殖效應(yīng)用STIM1的腺病毒干擾載體,干擾STIM1的蛋白表達(dá)。
　　 3.7 過(guò)表達(dá)c-Met對(duì)球囊損傷后血管再內(nèi)皮化的影響
　　 3.8 過(guò)表達(dá)c-Met對(duì)球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的影響
　　 4.結(jié)論:
　　 1)、HGF促進(jìn)EPCs的增殖;
　　 2)、HGF刺激EPCs引起了經(jīng)SOCCs的鈣離子內(nèi)流增加;
　　 3)、SOCCs阻斷劑明顯