攜帶VEGF基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能改變及在損傷血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文攜帶VEGF基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能改變及在損傷血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用姓名：趙剛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（心血管?。┲笇?dǎo)教師：黃嵐20071101第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文內(nèi)皮祖細(xì)胞。將構(gòu)建的攜帶人VEGF165基因的pcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至EPcs，觀察基因修飾對(duì)EPcs的粘附、遷移、增殖及向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響。復(fù)制實(shí)驗(yàn)大鼠股動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型，將轉(zhuǎn)染人VEGF165基因的EPCs移植入大鼠體內(nèi)，觀察基因修飾EPcs

2、歸巢至損傷內(nèi)膜及損傷血管段內(nèi)皮結(jié)構(gòu)變化，評(píng)價(jià)損傷血管段局部再內(nèi)皮化過程中基因修飾對(duì)EPCs的功能影響。將基因治療和干細(xì)胞治療方法聯(lián)合應(yīng)用在血管損傷的內(nèi)皮修復(fù)治療，探討基因修飾EPCs對(duì)損傷血管的再內(nèi)皮化、重建血管生物學(xué)功能、治療內(nèi)膜損傷性血管性疾病的作用。方法：1構(gòu)建攜帶人VEGFl65基因的真核表達(dá)質(zhì)粒：擴(kuò)增、提取質(zhì)粒pGEMhVEGFl65中hVEGFl65目的基因，插入pcDNA3質(zhì)粒載體，構(gòu)建含有hVEGFl65基因的真核表達(dá)質(zhì)

3、粒載體，酶切、測序鑒定。2EPcs的分離純化、培養(yǎng)、鑒定：采用密度梯度離心法從大鼠骨髓分離EPcs，原代培養(yǎng)后，透射電鏡觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，熒光倒置顯微鏡鑒定DiI—AcLDL與FITc—uEA—I染色雙陽性細(xì)胞為正在分化的EPcs。3對(duì)EPCs進(jìn)行vEGF基因轉(zhuǎn)染、擴(kuò)增，改良Boyden小室分析基因修飾EPCs的粘附、遷移能力，ELISA方法分析EPCs中VEGF水平、MTT法分析細(xì)胞的增殖活性。4復(fù)制血管內(nèi)膜損傷動(dòng)物模型，將

4、基因修飾EPCs移植到實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)，觀察轉(zhuǎn)基因EPcs歸巢、向內(nèi)皮細(xì)胞分化情況，分析基因修飾EPCs對(duì)損傷血管段局部再內(nèi)皮化的影響。結(jié)果：1重組質(zhì)粒通過酶切和測序鑒定證實(shí)了hvEGFl65定向插入到真核表達(dá)載體中。pcDNA3hVEGFl65可用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2EPCs的分離純化、培養(yǎng)、鑒定：密度梯度離心法分離的實(shí)驗(yàn)大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞。培養(yǎng)3天后，鏡下可見有細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)至7天貼壁細(xì)胞逐漸增多，并呈現(xiàn)鋪路石樣。用DiI—acLDL及