重組9型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染大鼠心臟成纖維細(xì)胞及對(duì)NF-kB通路的影響.pdf

1、目的：研究攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)報(bào)告基因的重組9 型腺相關(guān)病毒（rAAV9-EGFP)對(duì)大鼠心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，并研究攜帶有抗NF-κB 核酶基因的重組9 型腺相關(guān)病毒（rAAV9-EGFP-R65)對(duì)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB)的影響。方法：1．分離、獲取并培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細(xì)胞，以rAAV9-EGFp轉(zhuǎn)染大鼠心臟成纖維細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(mu

2、ltiplicities ofinfection, MOI)的不同將細(xì)胞分為MOI=0（未轉(zhuǎn)染病毒）組、MOI=1×104 組、MOI=1×105 組、MOI=1×106 組，采用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；2．觀察EGFp的表達(dá)情況并觀測(cè)表達(dá)高峰時(shí)間，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，評(píng)價(jià)并選擇出較好的MOI 以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；3．采用AlamarBlue 法檢測(cè)rAAV9-EGFp對(duì)細(xì)胞增殖的影響。4．同法分離、獲取并培養(yǎng)大鼠心臟

3、成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞分組為四組：對(duì)照組、轉(zhuǎn)染rAAV9-EGFP-R65 組、應(yīng)用TNF-α處理組以及轉(zhuǎn)染rAAV9-EGFP-R65后應(yīng)用TNF-α處理組，采用凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)NF-κB 活性，并采用蛋白質(zhì)印跡雜交法(Western blot)檢測(cè)NF-κB P65 蛋白的表達(dá)。結(jié)果：1．MOI=1×106 組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后24h 即可觀察到EGFp表達(dá)，MOI=1×104組和MOI=1×105 組細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染后48h 觀

4、察到EGFp表達(dá)。2．倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后大鼠心臟成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與形態(tài)未見到有異常變化，各組細(xì)胞EGFp表達(dá)的強(qiáng)度隨MOI 值的增高而增強(qiáng)，且可隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在轉(zhuǎn)染后120h 達(dá)到高峰，此時(shí)檢測(cè)rAAV9-EGFp對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為MOI=1×104 組：(2.6±0.2)%，MOI=1×105 組：(7.3±1.4)%，MOI=1×106 組：(45.1±2.7)%。3．AlamarBlue 法檢測(cè)表明

5、各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)與未轉(zhuǎn)染組的還原率比值接近于1，表明rAAV9-EGFp對(duì)大鼠心臟成纖維細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用。4．進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，在常態(tài)下大鼠心臟成纖維細(xì)胞NF-κB 具有一定的活性，在TNF-α作用下NF-κB 活性明顯可以明顯增高，而rAAV9- EGFP-R65 能夠抑制TNF-α作用下細(xì)胞內(nèi)NF-κB 活性增高；同時(shí)，rAAV9- EGFP-R65 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，NF-κB 活性基團(tuán)P65的表達(dá)受到抑制。結(jié)論：AAV9-EG