細胞凋亡在慢病毒介導hVEGF165-GFP基因轉染內(nèi)皮祖細胞移植治療MODS中變化的研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是重癥監(jiān)護病房患者的最常見死亡原因。嚴重的感染和感染性休克是其主要誘因。感染所致的膿毒癥及非感染所致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)相互作用，構成了一個復雜的網(wǎng)絡。目前其發(fā)病機制尚不完全明確，臨床上尚缺乏滿意的治療措施。隨著干/祖細胞研究的不斷深入，多器官功

2、能障礙綜合征的發(fā)病機制研究和臨床治療面臨著新的契機。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)：骨髓中有一群能夠在生理性或病理性因素的刺激下，動員到外周血并分化為成熟內(nèi)皮細胞(Endothelium cell，EC)以促進血管新生，并可以分化為相應的組織細胞進行損傷修復的祖細胞，這些細胞被稱為內(nèi)皮祖細胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)。EPC過去被認為是胚胎時期血管新生最主要的細胞，而越來越多的證據(jù)顯示EPCs也

3、是出生后生理性及病理性血管形成最主要的細胞，并參與心、肝、肺、腎等單個器官障礙時的修復；同時遷徙到損傷部位的EPC還可以對不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反應，依次釋放血管活性物質(zhì)、生長因子以及參與免疫調(diào)節(jié)的細胞因子和趨化因子，參與創(chuàng)傷后的炎癥反應。
　　 同時研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞不僅是炎癥反應的參與者，還是首先受損的靶細胞，并進而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。大量的動物和臨床實驗都已經(jīng)證明：當

4、組織受到損傷時，尤其是缺血性損傷時，循環(huán)及組織中EPCs動員和增殖能力增強，并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細胞替換功能障礙的內(nèi)皮細胞、修補裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū)，并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成，從而改善缺血器官的功能；而如果創(chuàng)傷后EPCs的分化、遷徙功能發(fā)生嚴重障礙，則會導致?lián)p傷微循環(huán)嚴重損害而無法得到修復，甚至發(fā)生器官功能衰竭。
　　 既往研究發(fā)現(xiàn)與MODS有關的細胞因子有白介素(IL-1，IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、熱休克

5、蛋白(HSP)、糖皮質(zhì)激素和細菌產(chǎn)物如內(nèi)毒素等，它們在導致SIRS/MODS細胞凋亡中具有潛在作用。通過對某些重要器官的細胞凋亡機制及其影響因素的研究可以更深入的了解MODS的機理，為臨床更好的防治MODS提供實驗依據(jù)。
　　 本研究通過內(nèi)毒素+失血性休克制造出MODS的動物模型，在此基礎上進行慢病毒介導VEGF-GFP基因轉染EPCs移植治療，動態(tài)觀察移植前后動物生命體征的變化，血漿中IL-1β、TNF-α等炎性因子表達的變化

6、，以及主要臟器的細胞凋亡情況，評價移植EPC防治MODS的效果，并對其作用機制進行初步探討。全文共分四部分：
　　 第一部分目的：復制雙相遲發(fā)型的兔MODS模型，為研究移植內(nèi)皮祖細胞防治創(chuàng)傷后多器官功能障礙的研究提供實驗基礎。方法：將體重2.52±0.27Kg健康雄性家兔隨機分為2組：實驗組(M組)12只，施行失血性休克+內(nèi)毒素血癥復合因素；對照組(C)12只，施行假手術，予以股動靜脈置管，不實施失血及內(nèi)毒素注射。用自動分析儀檢

7、測WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、動脈血氧分壓(PaO2)，以判斷器官功能，7天后處死存活動物，觀察主要臟器的病理改變。結果：實驗組(M組)WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均明顯升高，動物死亡前顯著高于正常值，PaO2明顯下降。病理學改變主要表現(xiàn)為衰竭器官呈以炎癥為主的非特異性改變。實驗組MODS發(fā)生率為83.3％，死亡率為75％，顯著高于對照組。結論：本實驗采用二次打擊方法，與臨床實際相符，并且M

8、ODS的發(fā)生率及死亡率均高，操作簡單，容易復制，是一個較成功的動物模型。
　　 第二部分目的：制備攜帶hVEGF165-GFPs雙表達基因的慢病毒載體，體外轉染內(nèi)皮祖細胞，為EPC移植治療做準備。方法：將目的基因VEFG165插入慢病毒過表達載體pWPXL-MOD，慢病毒包裝質(zhì)粒轉染293T細胞，得到LV/hVEGF165-GFP，將LV/hVEGF165-GFP與EPCs共培養(yǎng)以轉染EPCs。對LV/hVEGF165-GFP-

9、EPCs進行其黏附、遷徙、增殖和血管生成功能進行檢測。結果：慢病毒載體能表達目的基因VEGF，成功構建和包裝了慢病毒載體；并證實EPCs經(jīng)LV/hVEGF165-GFP轉染后轉染率達99％。其遷徙、增殖和血管生成等功能較未轉染EPCs提高，P＜0.05。結論：LV/hVEGF165-GFP對細胞無毒性，且能提高EPCs的粘附、遷徙及增殖能力。
　　 第三部分目的：研究細胞凋亡在慢病毒介導VEGF165-GFP基因轉染EPCs移植

10、治療MODS中的變化及意義。方法：將體重2.52±0.27Kg健康雄性家兔隨機分為3組：單純MODS組(M)12只，施行失血性休克+內(nèi)毒素復合因素；單純內(nèi)皮祖細胞移植組(ET)12只和慢病毒介導VEGF165-GFP基因轉染內(nèi)皮祖細胞移植組(VT)12只，在固定時間點，分別以1×107個細胞/Kg(體重)和1×107個轉染后細胞/Kg(體重)的劑量進行移植治療。用自動分析儀檢測WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、動脈血氧

11、分壓(PaO2)，以判斷器官功能，7天后處死存活動物，觀察主要臟器的病理改變。原位末端(TUNEL)法檢測主要臟器細胞凋亡情況。RT-PCR法檢測主要臟器caspase3mRNA表達情況。結果：VT組WBC、GRAN、GOT、GPT、Cr、BUN等指標在移植治療后較M組及ET組均有明顯改善，比較有統(tǒng)計學意義。VT組主要臟器細胞凋亡及caspase3mRNA表達均低于M組及ET組，P＜0.01。VT組動物的MODS發(fā)生率和死亡率較M組及E