成熟T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)及其慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSc）是利用病毒載體將特定轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)入分化細(xì)胞，使其重編程為類似胚胎干細(xì)胞的一類細(xì)胞。它不僅具有自我更新和多向分化潛能，而且在細(xì)胞形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、類胚體和畸形瘤生成能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。該技術(shù)是2006年由Yamanaka 將重組有Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的病毒載體引入小鼠成纖維細(xì)胞

2、，并成功誘導(dǎo)其重編程而最先創(chuàng)建的。在隨后的研究中，如何選用來源便捷、數(shù)目充足的成熟體細(xì)胞為重編程的靶細(xì)胞，成為iPS 研究的熱點(diǎn)之一。而具備上述選材條件的成熟T淋巴細(xì)胞，卻存在體外成活時(shí)間短和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率極低等技術(shù)難題。慢病毒（lentivirus）載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒 ((HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。在相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)

3、入甚至無法轉(zhuǎn)入的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞等未分化細(xì)胞，通過慢病毒介導(dǎo)的方法能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且使目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率也明顯增加，這為報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)的高效瞬時(shí)表達(dá)研究提供了有利途徑。本研究建立了適合小鼠成熟活化T淋巴細(xì)胞體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，以及慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)平臺(tái)，獲得的主要研究結(jié)果如下：1、成熟T淋巴細(xì)胞的增殖與活化。采用Ficoll 梯度離心法分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞，分別用刀豆蛋白A（ConA）和anti-mous

4、e CD3 &anti-mouse CD28等方法活化成熟T淋巴細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞法檢測(cè)T細(xì)胞表面CD4+CD44high等活化標(biāo)志；羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯（CFSE）示蹤法檢測(cè)活化細(xì)胞的增殖分裂狀況。結(jié)果顯示：可從3月齡的雌性Balb/c小鼠（SPF級(jí)）的脾臟中分離到～2×107單個(gè)核細(xì)胞；96孔“U ”型板經(jīng)anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28(終濃度分別為2μg/mL、4 μg/mL)包被后，

5、可使2.0×105個(gè)細(xì)胞/孔在第三天（D3）迅速增殖至1.6×106個(gè)細(xì)胞/孔，，經(jīng)過anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28 刺激活化的CD4+CD44highT淋巴細(xì)胞占活細(xì)胞總數(shù)的(74.0±1.8)％，且CFSE 強(qiáng)陽性細(xì)胞由原來(92.3±2.8)％降至(16.34±1.3)％；該活化T淋巴細(xì)胞在含IL-2（終濃度30ng/mL）CTL 培養(yǎng)基中可維持生長(zhǎng)（D14細(xì)胞數(shù)為1.5×106/孔）；而經(jīng)ConA

6、 刺激激活的T淋巴細(xì)胞在D7 才能達(dá)到最高值1.4×106個(gè)細(xì)胞/孔，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡增多，直至完全死亡。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了小鼠成熟T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能否保持長(zhǎng)期的增殖與活化狀況的可行性，為下一步進(jìn)行GFP 重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)奠定基礎(chǔ)。2、慢病毒的包裝及對(duì)成熟T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。采用脂質(zhì)體將GFP 重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞293T中，48小時(shí)后收集細(xì)胞上清液，進(jìn)一步用超速離心的方法純化GFP 重組慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)LEPC細(xì)胞D

7、2后，采用流式細(xì)胞法檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率和病毒滴度。最后將純化的GFP 重組慢病毒分別按MOI=1,5,10等不同滴度，轉(zhuǎn)染經(jīng)anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28 刺激激活的T淋巴細(xì)胞，并觀測(cè)GFP 重組慢病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示：經(jīng)脂質(zhì)體法將GFP 重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞293T,在48小時(shí)后，293T 全部帶有綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率為95％以上。未純化的GFP 重組慢病毒顆粒（500μl 病毒/孔）

8、轉(zhuǎn)導(dǎo)LEPC細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析GFP的陽性率為(85.9±3.6)％；而經(jīng)超離純化濃縮10倍的重組慢病毒組（50μl 病毒/孔），其GFP 陽性率仍達(dá)(74.3±1.8)％。純化后的GFP 重組慢病毒轉(zhuǎn)染經(jīng)anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28 刺激激活的T淋巴細(xì)胞3天后，GFP 陽性率分別為：MOI=1組 ((25.8±1.75)％，MOI=5組(36.0±9.5)％，MOI=10組 ((43.0±4.75