成熟T淋巴細胞分離培養(yǎng)及其慢病毒介導的基因轉染的研究.pdf

1、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPSc）是利用病毒載體將特定轉錄因子組合轉入分化細胞，使其重編程為類似胚胎干細胞的一類細胞。它不僅具有自我更新和多向分化潛能，而且在細胞形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、類胚體和畸形瘤生成能力等方面都與胚胎干細胞相似。該技術是2006年由Yamanaka 將重組有Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 四個轉錄因子基因的病毒載體引入小鼠成纖維細胞

2、，并成功誘導其重編程而最先創(chuàng)建的。在隨后的研究中，如何選用來源便捷、數目充足的成熟體細胞為重編程的靶細胞，成為iPS 研究的熱點之一。而具備上述選材條件的成熟T淋巴細胞，卻存在體外成活時間短和病毒轉導效率極低等技術難題。慢病毒（lentivirus）載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒 ((HIV-1)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。在相關的細胞實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉

3、入甚至無法轉入的細胞，如原代細胞、干細胞等未分化細胞，通過慢病毒介導的方法能夠大大提高基因的轉導效率，而且使目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率也明顯增加，這為報告基因在細胞內的高效瞬時表達研究提供了有利途徑。本研究建立了適合小鼠成熟活化T淋巴細胞體外長時間培養(yǎng)，以及慢病毒轉導的技術平臺，獲得的主要研究結果如下：1、成熟T淋巴細胞的增殖與活化。采用Ficoll 梯度離心法分離小鼠單個核細胞，分別用刀豆蛋白A（ConA）和anti-mous

4、e CD3 &anti-mouse CD28等方法活化成熟T淋巴細胞，并利用流式細胞法檢測T細胞表面CD4+CD44high等活化標志；羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯（CFSE）示蹤法檢測活化細胞的增殖分裂狀況。結果顯示：可從3月齡的雌性Balb/c小鼠（SPF級）的脾臟中分離到～2×107單個核細胞；96孔“U ”型板經anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28(終濃度分別為2μg/mL、4 μg/mL)包被后，

5、可使2.0×105個細胞/孔在第三天（D3）迅速增殖至1.6×106個細胞/孔，，經過anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28 刺激活化的CD4+CD44highT淋巴細胞占活細胞總數的(74.0±1.8)％，且CFSE 強陽性細胞由原來(92.3±2.8)％降至(16.34±1.3)％；該活化T淋巴細胞在含IL-2（終濃度30ng/mL）CTL 培養(yǎng)基中可維持生長（D14細胞數為1.5×106/孔）；而經ConA

6、 刺激激活的T淋巴細胞在D7 才能達到最高值1.4×106個細胞/孔，且隨著培養(yǎng)時間延長，細胞凋亡增多，直至完全死亡。實驗評價了小鼠成熟T淋巴細胞在體外培養(yǎng)條件下能否保持長期的增殖與活化狀況的可行性，為下一步進行GFP 重組慢病毒轉導奠定基礎。2、慢病毒的包裝及對成熟T淋巴細胞的轉染效率。采用脂質體將GFP 重組慢病毒質粒轉染到包裝細胞293T中，48小時后收集細胞上清液，進一步用超速離心的方法純化GFP 重組慢病毒，轉導LEPC細胞D

7、2后，采用流式細胞法檢測其轉染效率和病毒滴度。最后將純化的GFP 重組慢病毒分別按MOI=1,5,10等不同滴度，轉染經anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28 刺激激活的T淋巴細胞，并觀測GFP 重組慢病毒對T淋巴細胞的轉染效率。結果顯示：經脂質體法將GFP 重組慢病毒質粒轉染到包裝細胞293T,在48小時后，293T 全部帶有綠色熒光，轉染效率為95％以上。未純化的GFP 重組慢病毒顆粒（500μl 病毒/孔）

8、轉導LEPC細胞，經流式細胞儀分析GFP的陽性率為(85.9±3.6)％；而經超離純化濃縮10倍的重組慢病毒組（50μl 病毒/孔），其GFP 陽性率仍達(74.3±1.8)％。純化后的GFP 重組慢病毒轉染經anti-mouse CD3 &anti-mouse CD28 刺激激活的T淋巴細胞3天后，GFP 陽性率分別為：MOI=1組 ((25.8±1.75)％，MOI=5組(36.0±9.5)％，MOI=10組 ((43.0±4.75