黏膜浸潤T淋巴細胞介導胃癌病人免疫監(jiān)視及其機制研究.pdf

1、背景：
　　惡性腫瘤的發(fā)生在全世界范圍內(nèi)都是一個嚴重的健康問題。目前為止，手術切除仍然是實體腫瘤患者最主要的治療方式。腫瘤的TNM分期分型被廣泛的應用于術后病人的預后估計和輔助治療合理性評價。盡管在預測患者預后方面，TNM分期系統(tǒng)表現(xiàn)出一定的參考價值，但是僅僅依賴于腫瘤組織的病理學特征進行判斷仍然不夠準確。另一方面，絕大多數(shù)的人類實體腫瘤都伴隨著淋巴細胞的浸潤，并且長久以來，研究者一直認為通過對免疫應答的檢測可能可以用來預測腫瘤的

2、進展以及評價治療的效果。但是，受制于抗腫瘤免疫應答的系統(tǒng)性和復雜性，利用組織標本進行的免疫監(jiān)視始終缺乏實用性，并且其結(jié)果亦不夠可靠。得益于系統(tǒng)生物學和高通量檢測方法的進步，通過監(jiān)視免疫應答評價腫瘤患者生存已經(jīng)變?yōu)榭赡?。然而，現(xiàn)有的新的免疫標志物仍然不夠理想，其可靠性和準確性都需要進一步的確認。
　　人類腫瘤內(nèi)淋巴細胞的浸潤是一種普遍的病理現(xiàn)象，并且被認為是免疫監(jiān)視功能的重要的體現(xiàn)。在抗腫瘤免疫應答的過程中，幼稚T淋巴細胞被遞呈的腫

3、瘤相關抗原/腫瘤特異性抗原活化，接著進入外周組織開始進一步的分化并收斂形成免疫記憶。現(xiàn)有假設認為，腫瘤相關抗原特異性的記憶T細胞在腫瘤術后病人的免疫監(jiān)視中發(fā)揮了重要的功能，阻礙腫瘤患者的復發(fā)。但是，組織駐留的記憶T淋巴細胞對抗腫瘤復發(fā)的監(jiān)視能力仍然不清楚。
　　當與抗原提呈細胞相遇的時候，T細胞會識別抗原提呈細胞表面的肽段，并且這一過程具有顯著的特異性和靈敏性。T淋巴細胞應答的特異性很大程度上來源于 T細胞受體與抗原肽-MHC復合

4、物的親和力強弱。T淋巴細胞在胸腺內(nèi)的早期發(fā)育過程中，TCRA和TCRB基因座位通過體細胞重組產(chǎn)生TCR多樣性。在不同片段之間編碼的DNA序列編碼的區(qū)域叫做互補決定區(qū)3（CDR3）。這一區(qū)域?qū)乖挠兄顝姷慕Y(jié)合能力，并且是 TCR特異性和抗原識別的決定性因素。因此，T細胞接到的抗腫瘤免疫應答最核心的特征–抗原特異性 T細胞克隆的局部擴增，以及隨后的腫瘤內(nèi)T細胞受體庫的群體水平的漂移–可以通過CDR3的克隆富集和多樣性來反映。
　　

5、傳統(tǒng)的分析方法包括基于特異性抗體的流式細胞儀檢測，基于PCR擴增的CDR3長度分布譜分析等。這些方法都只能為腫瘤內(nèi)T細胞受體庫的組成提供非常有限的信息。最近，通過高通量測序進行的T細胞受體庫分析已經(jīng)提供了系統(tǒng)全面的數(shù)據(jù)來理解獲得性免疫應答的過程。在這項研究中，我們通過一組胃癌病人來研究腫瘤內(nèi) T細胞受體庫組成特征與病人預后的關系。我們發(fā)展了一種TCRB測序方法，可以均衡測序通量的需要和經(jīng)濟花費，使大規(guī)模的臨床樣品篩查成為可能。通過數(shù)據(jù)挖

6、掘，我們嘗試回答下列問題：1，腫瘤浸潤T淋巴細胞受體庫的擴增和多樣性變化；2，腫瘤內(nèi)擴增T細胞克隆的來源和轉(zhuǎn)歸；3，T細胞受體庫和患者臨床預后之間的關系。
　　結(jié)果：
　　1．TCR深度測序技術用于冰凍組織樣品的免疫組庫檢測
　　為了更好的理解T細胞參與抗腫瘤免疫應答的相關機制，我們發(fā)展了一種基于高通量測序技術的TCR組成分析方法。這一技術方案可以使用很少量的臨床樣品完成TCR的測序工作，并且同時平衡經(jīng)濟上的可承受性和

7、測序深度的需要。通過對覆蓋深度和測序重復性的檢測，我們證明了該測序方案可以有效的覆蓋待測樣品中的高頻率克隆。并且，我們同時發(fā)現(xiàn)在沒有免疫刺激的條件下，T細胞群體中的高頻克隆的頻率十分穩(wěn)定。
　　2．胃癌患者的個體間差異可能掩蓋CDR3分布差異
　　通過對胃癌患者腫瘤組織，癌旁黏膜和外周血的測序，我們測定了不同樣品的CDR3長度分布，并且發(fā)現(xiàn)不同組織的TCR CDR3長度分布沒有顯著差別。此外，通過對患者外周血和健康對照外周血

8、的比較，我們依然沒有發(fā)現(xiàn)TCR CDR3長度上的區(qū)別。
　　3．腫瘤浸潤T細胞中含有大量高擴增克隆
　　在患者腫瘤組織T細胞受體庫中，頻率最高的10％的克隆占據(jù)了T細胞全體的73.7%；而對于癌旁粘膜和外周血，其頻率最高的10%的克隆分別占全部T細胞群體的57.3%和69.4%。此外，在群體水平上，不同組織內(nèi)高頻克隆的比例也有顯著的差別（TCRB NT克隆，腫瘤內(nèi)19.3%±12.5%；粘膜內(nèi)5.1%±5.6%，外周血內(nèi)7.

9、4%±6.5%；CDR3 AA克隆，腫瘤內(nèi)34.0%±19.0%；粘膜內(nèi)10.8%±9.1%，外周血內(nèi)14.0%±12.0%）。
　　4．腫瘤浸潤T細胞受體庫多樣性下降
　　通過計算NSDE多樣性系數(shù)，與癌旁粘膜和外周血內(nèi)的TCR庫相比，腫瘤內(nèi)浸潤T細胞受體的多樣性顯著下降，并且這一結(jié)論對于TCRB NT克隆和CDR3 AA克隆同時成立（TCRB NT克隆，腫瘤內(nèi)0.84；粘膜內(nèi)0.92，外周血內(nèi)0.90；CDR3 AA克隆

10、，腫瘤內(nèi)0.77；粘膜內(nèi)0.88，外周血內(nèi)0.86）。
　　5．腫瘤內(nèi)高擴增克隆呈現(xiàn)抗原驅(qū)動擴增特征
　　通過進一步分析我們發(fā)現(xiàn)，對于所有組織內(nèi)T細胞克隆來講，頻率更高的克隆，且CDR3區(qū)域氨基酸序列的核酸編碼程度通常也更復雜，提示我們抗原驅(qū)動擴增事件在不同組織內(nèi)均有發(fā)生。但是，我們同時發(fā)現(xiàn)在腫瘤內(nèi)的高頻 T細胞克隆的頻率顯著高于對照組織內(nèi)（平均克隆頻率為腫瘤內(nèi)0.98%，粘膜內(nèi)0.73%，外周血內(nèi)0.80%），并且其CDR

11、3區(qū)域氨基酸序列的核酸編碼方式也更為復雜（平均CDR3編碼方式為腫瘤內(nèi)17，粘膜內(nèi)14，外周血中15）。腫瘤高頻率腫瘤內(nèi)T細胞克隆的復雜CDR3編碼方式提示我們高擴增克隆可能是在腫瘤相關抗原驅(qū)動下增殖的。
　　6．粘膜內(nèi)T細胞主要由組織滯留性T記憶細胞組成
　　為了了解粘膜內(nèi)T細胞的免疫表型，我們?nèi)⌒迈r粘膜組織樣品進行 T細胞單細胞分離，之后通過流式細胞儀進行免疫表型的檢測。我們的數(shù)據(jù)顯示，粘膜內(nèi) CD3陽性細胞中CD8陽性

12、與CD陰性（絕大部分為CD4陽性）T細胞的比例接近于1：1。對于CD8陽性T細胞，超過2/3的都是CD103hiCD45RO+CD69hiCD62L- CD8+ T細胞，這一表型與現(xiàn)有的對于滯留性T記憶細胞的認識相一致。
　　7．粘膜內(nèi)T細胞受體庫多樣性與患者預后呈正相關
　　粘膜內(nèi) T細胞受體庫的多樣性系數(shù)對于胃癌患者的長期生存和短期生存都有一定的預測作用：粘膜內(nèi)T細胞群體多樣性較低的患者其臨床預后也越差。進一步的，通過C

13、OX多因素方差分析發(fā)現(xiàn)，本研究中粘膜內(nèi)TCR多樣性系數(shù)是胃癌患者臨床預后的獨立相關指標，與患者的其他臨床特征無相關性。
　　結(jié)論：
　　1．TCR深度測序技術用于冰凍組織樣品的免疫組庫檢測；
　　2．胃癌患者的個體間差異可能掩蓋CDR3分布差異；
　　3．腫瘤浸潤T細胞中含有大量高擴增克?。?br>　　4．腫瘤浸潤T細胞受體庫多樣性下降；
　　5．腫瘤內(nèi)高擴增克隆呈現(xiàn)抗原驅(qū)動擴增特征；
　　6．粘膜內(nèi)