慢病毒介導(dǎo)的KIF5B-RET融合基因轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞株的初步研究.pdf

1、目的:肺癌目前仍是全球范圍內(nèi)引起癌癥死亡的主要原因，晚期肺癌治療以化療為主，但其療效已達到平臺，隨著肺癌分子生物學(xué)的發(fā)展以及相關(guān)檢測手段的完善，分子靶向治療NSCLC已經(jīng)成為近年來的熱點。其中EGFR突變通路研究最為深入，多個東西方大型臨床試驗表明(EGFR-Tyrosine Kinase Inhibitor)EGFR-TKI對EGFR活化突變的肺癌患者療效良好。在肺癌發(fā)生過程中，除基因突變之外，基因易位重排或基因融合同樣起著重要的作用

2、。繼ALK、ROS融合基因之后，KIF5B-RET融合基因為最新發(fā)現(xiàn)的肺癌融合基因，相關(guān)基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實KIF5B-RET融合基因具有促進細胞增殖和轉(zhuǎn)染成瘤的能力。但目前無論KIF5B-RET融合基因的功能性研究還是藥物敏感性研究僅限于小鼠細胞系，該融合基因在人類細胞中的致癌特性尚未得知。BEAS-2B細胞為正常人支氣管上皮細胞，是模擬肺癌體外模型較為理想的細胞系，可排除肺癌細胞其他原癌基因靶點激活的干擾，且目前未發(fā)現(xiàn)用該細胞來研究KI

3、F5B-RET融合基因的報道。本研究主要應(yīng)用慢病毒感染的手段構(gòu)建KIF5B-RET融合基因陽性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞株并初步探討KIF5B-RET融合基因?qū)EAS-2B細胞的抑制細胞凋亡的作用，為后續(xù)的KIF5B-RET功能研究和藥物敏感性研究提供載體平臺。
　　方法:以KIF5B-RET融合基因融合點附近的BamHI位點為界，利用分段PCR的方法先分別擴增出KIF5B基因片段和RET基因片段，進行電泳鑒定。各片段分別與p

4、EASY-Blunt Zero Cloning載體進行連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5a，擴菌后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和直接測序鑒定。帶NheI、BamHI位點的KIF5B質(zhì)粒片段和帶BamHI、SalI位點的RET質(zhì)粒片段一起與pCDH-CMV-MCS慢病毒表達載體進行連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5a，擴菌后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和直接測序鑒定。用pMDLg/pRRE、pRSV-REV、pMD2.G、KIF5B-RET-pCDH四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染29

5、3T細胞進行KIF5B-RET慢病毒的包裝和生產(chǎn)，收集上清病毒液，感染處于對數(shù)生長期的BEAS-2B細胞，感染72小時后提取細胞RNA和蛋白進行RT-PCR和口Western blot分別檢測KIF5B-RET融合基因mRNA和蛋白表達水平。PI單染色法流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后BEAS-2B細胞凋亡。
　　結(jié)果:RET基因有variant2和variant4兩種形式，本研究分段PCR擴增得到KIF5B片段、RET variant2片段

6、和variant4片段，電泳條帶位置與理論大小相符。pEasy-KIF5B、pEasy-RET V2、pEasy-RET V4質(zhì)粒酶切條帶位置與理論大小相符，測序鑒定結(jié)果和標準序列基本完全吻合。KIF5B-RET V2-pCDH、KIF5B-RETV4-pCDH慢病毒穿梭質(zhì)粒酶切條帶位置與理論大小相符，測序鑒定結(jié)果和標準序列基本完全吻合。pCDH-CMV-MCS-EGFP重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞及BEAS-2B細胞48小時熒光蛋白

7、表達強，熒光亮度90％以上。RT-PCR檢測結(jié)果顯示KIF5B-RET-PCDH慢病毒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞后KIF5B-RET融合基因mRNA表達明顯，Western blot檢測結(jié)果顯示KIF5B-RETv2-PCDH慢病毒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞后KIF5B-RET融合蛋白表達明顯。經(jīng)去血清處理12小時后，KIF5B-RET V2轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞發(fā)生凋亡的比例為5.49％、5.98％、5.6％，EGFP轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞發(fā)