煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及其機(jī)制.pdf

1、煤焦瀝青(coal tar pitch,CTP)是煤炭在煉焦過(guò)程中的副產(chǎn)物,成分極其復(fù)雜,流行病學(xué)調(diào)查顯示,煤焦瀝青接觸者肺癌的發(fā)病率明顯高于非接觸者,現(xiàn)已將煤焦瀝青引發(fā)的腫瘤劃定為職業(yè)腫瘤。在以往的研究中,多是以煤焦瀝青的某單一成分為研究對(duì)象來(lái)探討煤焦瀝青對(duì)接觸人群的危害和致癌機(jī)制的,而煤焦瀝青這一混合物的致癌機(jī)制如何,鮮見(jiàn)報(bào)道,需要進(jìn)一步研究。
　　 該研究利用中溫煤焦瀝青煙提取物(coal tar pitch smoke

2、extract)作為誘導(dǎo)劑,建立永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的惡性轉(zhuǎn)化模型,在確定細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的前提下,對(duì)細(xì)胞整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行分期,觀察不同時(shí)期細(xì)胞的染色體不穩(wěn)性,通過(guò)研究染毒細(xì)胞染色體損傷及惡性轉(zhuǎn)化早期紡錘體檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)基因及蛋白的改變,探討煤焦瀝青煙提取物致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性及其可能的致肺癌機(jī)制,為進(jìn)一步研究煤焦瀝青接觸者罹患職業(yè)性肺癌發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建

3、立
　　 制備煤焦瀝青煙提取物,通過(guò)細(xì)胞活力技術(shù)的方法測(cè)定合適的染毒劑量誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,并觀察BEAS-2B細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞表型的改變情況。
　　 2染色體不穩(wěn)定性觀察
　　 觀察細(xì)胞受煤焦瀝青煙提取物作用后傳代過(guò)程中染色體的動(dòng)態(tài)變化,觀察染色體不穩(wěn)定性。
　　 3煤焦瀝青煙提取物遺傳毒性及紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能檢測(cè)
　　 用彗星實(shí)驗(yàn)分析觀察煤焦瀝青煙提取物染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞造成的遺傳毒性進(jìn)行

4、觀察；RealTime PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)紡錘體檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)基因Mad2,Bub1及其蛋白的表達(dá)情況。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),以(x)±s表示。兩組數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗(yàn),構(gòu)成比比較采用x2檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
　　 染

5、毒組20代細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞體積增大,圓形類圓形細(xì)胞比例增加,部分細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣改變,胞漿豐富,錨定獨(dú)立生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞惡性程度不高,僅有極少數(shù)細(xì)胞3周時(shí)可以長(zhǎng)成大的集落；30代,細(xì)胞大小差異顯著,形態(tài)大部分變?yōu)閳A形類圓形,面積增大,細(xì)胞內(nèi)顆粒物增加,部分邊緣呈膜狀向外擴(kuò)展,軟瓊脂克隆形成細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后生長(zhǎng)紊亂,無(wú)接觸抑制,細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。流式細(xì)胞儀測(cè)定30代細(xì)胞的細(xì)胞周期顯示G1期細(xì)胞比例明顯減少,G2/M期

6、細(xì)胞比例明顯增加。
　　 2染色體不穩(wěn)定性的觀察
　　 惡性轉(zhuǎn)化早期染毒組細(xì)胞已表現(xiàn)出明顯的染色體不穩(wěn)定性,差異較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),主要表現(xiàn)為細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常,且異常細(xì)胞數(shù)目隨著細(xì)胞代數(shù)的增加有逐漸增多的趨勢(shì)。
　　 3煤焦瀝青煙提取物遺傳毒性及紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能檢測(cè)
　　 煤焦油煙提取物可對(duì)受試細(xì)胞的DNA造成損傷,染毒組細(xì)胞拖尾長(zhǎng)度較對(duì)照組均明顯增高(P＜0.05)。染毒組30