THP-1細(xì)胞對煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞TNF-α和AP-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 煤焦瀝青(Coaltarpitch，CTP)是煤炭煉焦過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。CTP煙塵主要通過呼吸道和皮膚對機體造成毒性反應(yīng)，能導(dǎo)致機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)能激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答致腫瘤細(xì)胞的凋亡，也能促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。正常情況下，炎癥具有自限性，若炎癥反應(yīng)過度，促炎因素持續(xù)存在，轉(zhuǎn)換為慢性炎癥能招募大量炎癥細(xì)胞分泌細(xì)胞因子與細(xì)胞外基質(zhì)形成新的微環(huán)境。激活蛋白-1(ActivityProtei

2、n-1，AP-1)的活化是炎癥細(xì)胞活化的早期標(biāo)志，AP-1的表達(dá)增加與炎癥細(xì)胞合成和釋放炎癥因子有關(guān)。
　　 本課題通過建立人單核細(xì)胞(THP-1)與人支氣管上皮細(xì)胞(ImmortalizedHumanBronchialEpithelialCell，BEAS-2B)共培養(yǎng)模型，模擬人體的炎癥微環(huán)境，檢測煤焦瀝青煙提取物(CoalTarPitchSmokeExtracts，CTPE)刺激共培養(yǎng)細(xì)胞后BEAS-2B細(xì)胞中AP-1的表

3、達(dá)，及阻斷腫瘤壞死因子-α(TumorNecrosisFactor-α,TNF-α)和AP-1的表達(dá)后其下游介導(dǎo)的相關(guān)基因表達(dá)的變化，來探討職業(yè)接觸煤焦瀝青煙導(dǎo)致機體發(fā)生慢性炎癥的可能機制。
　　 方法:
　　 1.CTPE染毒THP-1細(xì)胞實驗:CTPE刺激THP-1細(xì)胞24、48、72h，并設(shè)立空白對照組、二甲基亞砜(DimethylSulfoxide，DMSO)溶劑對照組。收集THP-1細(xì)胞及培養(yǎng)上清。利用實時熒光

4、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timefluorescentquantitativePolymeraseChainReaction，Real-timePCR)檢測CTPE染毒不同時間點THP-1細(xì)胞TNF-αmRNA相對表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附測定(EnzymeLinkedImmuno-sorbentAssay，ELISA)檢測THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)水平。
　　 2.CTPE染毒BEAS-2B與THP-1

5、共培養(yǎng)細(xì)胞實驗:設(shè)立DMSO溶劑對照組、CTPE組、BEAS-2B與THP-1細(xì)胞以30∶1比例共培養(yǎng)組（CC組），收集1、5、10、15、20代BEAS-2B細(xì)胞，采用Real-timePCR檢測c-JunmRNA表達(dá)水平的變化。
　　 3.TNF-α中和抗體和JNK激酶抑制劑對共培養(yǎng)組BEAS-2B細(xì)胞基因表達(dá)的影響:將CTPE染毒共培養(yǎng)組第9代細(xì)胞(CC9)分為4組，第1組長滿收集BEAS-2B細(xì)胞，記為CC10組;第2組

6、常規(guī)培養(yǎng)至15代，記為CC15組;第3組每代加入TNF-α中和抗體，終濃度為100tg/ml，記為中和抗體組;第4組每代加入JNK激酶抑制劑SP600125，終濃度為2.2μg/ml，記為SP600125組。中和抗體組和抑制劑組養(yǎng)至15代收集BEAS-2B細(xì)胞，同時同步培養(yǎng)一瓶正常BEAS-2B細(xì)胞作為空白對照組。應(yīng)用Real-TimePCR檢測各組細(xì)胞c-Jun、TRAF2、CyclinD1mRNA的相對表達(dá)水平。
　　 結(jié)果

7、:
　　 1.THP-1細(xì)胞TNF-α的表達(dá)水平:結(jié)果顯示CTPE刺激THP-1細(xì)胞72hTNF-α的mRNA和蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2.BEAS-2B細(xì)胞c-JunmRNA相對表達(dá)水平:按不同傳代次數(shù)分組進(jìn)行單因素方差分析，1代和5代CTPE組和CC組BEAS-2B細(xì)胞c-JunmRNA相對表達(dá)水平高于空白對照組和DMSO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);10代、15代和20

8、代細(xì)胞組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與正常對照組、DMSO組和CTPE組比較，CC組BEAS-2B細(xì)胞c-JunmRNA相對表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 按不同處理因素分組進(jìn)行單因素方差分析，CTPE組15代和20代BEAS-2B細(xì)胞c-JunmRNA相對表達(dá)水平高于1、5、10代細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CC組20代BEAS-2B細(xì)胞c-JunmRNA相對表達(dá)水平高于1

9、、5、10、15代細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 CTPE組和CC組BEAS-2B細(xì)胞c-junmRNA表達(dá)水平與細(xì)胞傳代次數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05）。即隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，CTPE組和CC組BEAS-2B細(xì)胞c-JunmRNA表達(dá)水平隨之升高，且CC組c-JunmRNA表達(dá)水平高于CTPE組。
　　 3.中和抗體和抑制劑對共培養(yǎng)組BEAS-2B細(xì)胞c-Jun、TRAF2、CyclinD1mRNA相

10、對表達(dá)水平的影響:
　　 3.1TNF-α中和抗體對各組BEAS-2B細(xì)胞基因表達(dá)的影響:TNF-α中和抗體組c-Jun和CyclinD1mRNA相對表達(dá)水平均高于正常對照組和CCl0組，低于CCl5組BEAS-2B細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;TNF-α中和抗體組TRAF2mRNA相對表達(dá)水平高于正常對照組，低于CCl5組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2JNK激酶抑制劑SP60012

11、5對各組BEAS-2B細(xì)胞基因表達(dá)的影響:SP600125組c-JunmRNA相對表達(dá)水平高于正常對照組，低于CCl5組BEAS-2B細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);SP600125組TRAF2和CyclinD1mRNA相對表達(dá)水平均高于正常對照組和CCl0組，低于CCl5組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)可能對煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子T