煤焦瀝青煙提取物致支氣管上皮細胞BEAS-2B染色體不穩(wěn)定性研究.pdf

1、背景:煤焦瀝青(CTP)是最早被發(fā)現(xiàn)的化學致癌物之一,它與職業(yè)性腫瘤的發(fā)生密切相關,但其誘導腫瘤的發(fā)病機制仍不清楚。本文主要通過研究煤焦瀝青煙提取物誘導BEAS-2B細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中染色體變化,探討染色體不穩(wěn)定性(CIN)在癌變過程中的作用。
　　 染色體不穩(wěn)定性是指細胞在有絲分裂過程中喪失和(或)獲得整條染色體或染色體片段頻率的升高。絕大多數(shù)腫瘤表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定性,是惡性細胞最顯著的特征之一。
　　 染色體不穩(wěn)定性

2、主要表現(xiàn)為數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變。染色體數(shù)目的改變,又叫非整倍體,是指整條染色體的獲得或丟失;染色體結(jié)構(gòu)的改變包括染色體的缺失、擴增、倒位、易位、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體等改變。
　　 染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生牽涉到細胞周期的各個環(huán)節(jié)。主要分為有絲分裂過程中姊妹染色單體分離異常、中心體異常、紡錘體檢測點功能缺陷以及端粒異常等4大方面。
　　 1.姊妹染色單體分離及凝聚異常:DNA復制后,黏連素將2條染色單體包繞在環(huán)中保證姊妹染色單

3、體配對。當Sccl亞基被分離酶(Separase)切開后,染色單體就會很容易被釋放出來。在細胞周期的大部分時間內(nèi),分離酶與保全素(Securin)結(jié)合而其水解酶活性被抑制。在細胞周期中期到后期進行中,保全素被降解,釋放分離酶,降解黏連素,使姊妹染色單體分離。
　　 2.紡錘體檢測點功能減弱:如果Mad或Bub基因突變或表達降低,細胞會忽略紡錘體的損傷而繼續(xù)分裂,從而形成異常核型。當檢測到有未正確連接的動粒時,檢測點相關蛋白Mad

4、2被激活從而抑制后期促進復合物APC/C的活性,使保全素不能被水解,從而使姊妹單體不能分離。存腫瘤細胞中,紡錘體檢測點功能較其正常組織明顯減弱,并伴隨高頻率CIN。
　　 3.中心體異常:中心體異常與非整倍體和CIN呈正相關,并在實體腫瘤中普遍存在。中心體過表達存肺痛中很常見,并伴有明顯不典型的形態(tài)、大小和數(shù)量異常。中心體的復制過程受到嚴格地調(diào)控。CDK2/CyclinE復合物在中心體復制的調(diào)控中起非常重要的作用。P53可以依賴

5、P53/P21通路抑制CDK2/CyclinE的活性米調(diào)控中心體復制,P53失活或表達量降低和CyclinE頻繁地過度表達,將會導致中心體擴增。P53與染色體不穩(wěn)定/中心體擴增間存在正相關的關系。中心體異常導致染色體不穩(wěn)定,對腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生深遠的影響。
　　 4.端粒、端粒酶異常:絕大部分腫瘤細胞的端粒縮短,端粒酶活性升高,以維持細胞的永生化。端粒縮短到一定程度將引起端粒末端的融合,引起“橋接-融合-斷裂”循環(huán)導致染色體不穩(wěn)定,

6、最終演化為腫瘤細胞的核型,產(chǎn)生癌變。TRF1主要負責負性調(diào)節(jié)端粒的長度,控制端粒的延伸。TRF2主要負責保護染色體的末端。TRF2丟失將會導致染色體末端失去保護,造成端粒3’端丟失和染色體末端-末端融合。POT1的作用主要是保護端粒末端單鏈DNA并與調(diào)控端粒酶的活性有關。
　　 核型分析表明,幾乎所有的肺癌都表現(xiàn)出復雜的核型,大約發(fā)70％～80％的肺癌具有三倍體、四倍體核型,并伴有染色體易位、缺失和異染色質(zhì)等多種結(jié)構(gòu)的變異。染色

7、體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變均可引起染色體基因成分的改變。
　　 腫瘤細胞普遍存在的染色體不穩(wěn)定性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、演化過程中起到何種作用,目前尚有爭論。
　　 本研究利用中溫煤焦瀝青煙提取物作為誘導劑,建立永生化人支氣管上皮細胞BEAS-2B的惡性轉(zhuǎn)化模型,在確定細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的前提下,觀察細胞整個轉(zhuǎn)化過程中不同時期染色體改變與細胞轉(zhuǎn)化之間的關系,并對其可能的機制從姊妹染色單體分離及凝聚異常、紡錘體檢測點功能的減弱、中心體異

8、常和端粒、端粒酶異常等4個方面加以分析,以探討煤焦瀝青的致肺癌機制,為預防煤焦瀝青接觸者罹患職業(yè)性肺部腫瘤提供理論依據(jù)。
　　 研究目的:分析煤焦瀝青豐成分,建立人支氣管上皮細胞BEAS-2B的惡性轉(zhuǎn)化模型;觀察不同時期細胞的染色體不穩(wěn)定性與細胞惡性轉(zhuǎn)化之間的關系;
　　 從姊妹染色單體分離及凝聚異常、紡錘體檢測點功能的減弱、中心體異常和端粒、端粒酶異常等4個方面分析染色體不穩(wěn)性的機制,探討煤焦瀝青的致肺癌機制,為預防煤

9、焦瀝青接觸者罹患職業(yè)性肺部腫瘤提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1、實驗材料:中溫煤焦瀝青:從安陽鋼鐵公司焦化廠獲得,碾碎成10μm～20μm的微細粉,溫度控制在400℃左有,任其產(chǎn)生煙霧,用粉塵采樣器收集煙塵,二氯甲烷提取,DMSO溶解后常溫保存?zhèn)溆谩?br>　　 細胞株:永生化人支氣管上皮細胞BEAS-2B細胞株。
　　 裸鼠:BALB/C裸鼠24只,雌性,SPF級,5-6周齡,體重10-20g,購

10、白湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。
　　 2、方法
　　 2.1煤焦瀝青煙提取物成分分析和對BEAS-2B細胞毒性實驗：取煤焦瀝青DMSO溶液,用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析鑒定。通過NIST質(zhì)譜庫自動檢索獲得各成分鑒定結(jié)果,按照峰面積歸一法進行相對定量分析。用MTT法檢測煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞的毒性實驗,并計算LC50。
　　 2.2煤焦瀝青煙提取物誘導BEAS-2B惡性轉(zhuǎn)化和染色體不穩(wěn)定性觀察：

11、以2.0 mg/L煤焦瀝青煙提取物誘導并觀察BEAS-2B細胞傳代轉(zhuǎn)化過程中的形態(tài)學改變;檢測細胞的錨著獨立性生長能力并用裸鼠成瘤實驗加以驗證,用傳統(tǒng)核型分析方法觀察細胞染色體的動態(tài)變化。細胞出現(xiàn)形態(tài)學改變時,用流式細胞術檢測細胞增殖周期變化并用M-FISH法觀察細胞的染色體細微結(jié)構(gòu)改變。煤焦瀝青對細胞DNA損傷作用的檢測:用誘導劑量(2.0 mg/L),對細胞染毒24 h,單細胞凝膠電泳觀察煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞造成的D

12、NA損傷作用。
　　 2.3煤焦瀝青煙提取物致BEAS-2B細胞染色體不穩(wěn)定性機制分析：對誘導后第10、20和30代細胞均用間接熒光免疫法檢測中心體的改變,用熒光定量PCR法檢測端粒長度改變,熒光定量TRAP法檢測細胞的端粒酶活性。用實時定量RT-PCR檢測各組相關基岡的mRNA表達水平;采用細胞爬片免疫組化的方法半定量檢測相關基因的蛋白表達改變。
　　 3.統(tǒng)計學分析：采用SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,對符合正

13、態(tài)分布的數(shù)據(jù),以x±s表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,以a=0.05為檢驗水準(雙側(cè))。
　　 結(jié)果:
　　 1.煤焦瀝青煙提取物成分分析和對BEAS-2B細胞的急性毒性實驗
　　 1.1成分分析：煤焦瀝青煙提取物中總計鑒定出的38種化合物,主要為多環(huán)芳烴類,占已鑒定成分的87.91％,其余主要為單環(huán)芳烴類、雜環(huán)類和烯烴類化合物。
　　 1.2細胞毒性實驗：煤焦瀝青煙提取物對于

14、BEAS-2B細胞生長的抑制作用隨著劑景的加大而逐漸增強,呈對稱S型曲線,LC50為8.64mg/L。
　　 2.煤焦瀝青煙提取物致BEAS-2B細胞的轉(zhuǎn)化和染色體不穩(wěn)定性作用：以LC50的20％左有的劑量作為誘導劑量(2.0 mg/L)誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化,經(jīng)過30代傳代培養(yǎng),細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　 2.1細胞形態(tài)學觀察：第10代時,細胞形態(tài)無明顯改變:第20代,誘導組部分細胞形態(tài)異常,生長代謝旺盛;第30代,誘導組細胞

15、排列雜亂無規(guī)則,大小差異顯著,細胞生長失去接觸抑制,出現(xiàn)復層生長現(xiàn)象,可見異形核及病理性核分裂相。
　　 2.2細胞周期改變：染毒組細胞傳代至30代,流式細胞儀測定其細胞周期顯示G1期細胞比例明顯減少,G2/M期細胞比例明顯增加,表明細胞正處于增殖旺盛狀態(tài),其周期較對照組已呈不同程度的生長加速現(xiàn)象。
　　 2.3軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠成瘤實驗：第10代細胞煤焦瀝青組有克隆形成,形成率極低(0.4‰)。而第20代誘導組細

16、胞克隆形成率升高,為5.93‰,高于其他兩組,并且可看到明顯的克隆集落;第30代時,煤焦瀝青組細胞即能在軟瓊脂上形成陽性克隆,細胞克隆形成率為21.50‰,遠遠高于正常對照組和DMSO組。形態(tài)學上,煤焦瀝青組形成的克隆生長紊亂,無接觸抑制,可見重疊生長。煤焦瀝青誘導30代細胞組接種裸鼠38d后,移植瘤的體積和重量均明顯人于其它3組,差異有統(tǒng)計學意義。瘤體HE染色結(jié)果顯示,煤焦瀝青誘導的第30代細胞在裸鼠體形成的腫瘤,組織結(jié)構(gòu)紊亂,核異形

17、明顯并可以發(fā)現(xiàn)小血管形成。說明30代細胞已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化。
　　 2.4染色體不穩(wěn)定性的觀察：煤焦瀝青誘導組第10代細胞二倍體核型的比例明顯下降,非整倍體細胞的比例明顯增加,尤其是亞二倍體和超二倍體的比例升高較多,采用列聯(lián)表x2檢驗分析,3組間細胞染色體數(shù)目差異有統(tǒng)計學意義。X2分割后分析,煤焦瀝青組與正常對照組和DMSO組間染色體數(shù)目差異有統(tǒng)計學意義,但正常對照組與DMSO組問比較差異無統(tǒng)計學意義。煤焦瀝青組第20代細胞二倍體核型

18、比例進一步減少(17％),亞二倍體(19％)、超二倍體(62％)所占的比例進一步增高。煤焦瀝青誘導組第30代細胞染色體二倍體核型比例更少(7％),出現(xiàn)了大量非整倍體細胞,其中包括亞二倍體(15％)和超二倍體(78％)。
　　 M-FISH結(jié)果表明BEAS-2B細胞本身已經(jīng)處于不穩(wěn)定的核型,其染色體數(shù)目雖然以近二倍體為主,但是其染色體結(jié)構(gòu)中有人量的交叉互換。煤焦瀝青誘導組BEAS-2B細胞核型極不穩(wěn)定,出現(xiàn)大量的多倍體核型和亞2倍

19、體核型,染色體有大量的移位,交叉互換和缺失,每個細胞核型的細微結(jié)構(gòu)都有差異。
　　 2.5煤焦瀝青煙提取物對BEAS-28細胞的DNA損傷作用：用誘導劑量(2.0mg/l),對細胞染毒24h,單細胞凝膠電泳結(jié)果顯示,煤焦瀝青組尾長,尾距,彗星長和Olive尾矩均顯著增加,與空白對照組和DMSO組相比較有統(tǒng)計學意義。說明煤焦瀝青可以直接作用于BEAS-2B細胞引起DNA損傷,產(chǎn)生遺傳毒性。
　　 3、煤焦瀝青煙提取物致BE

20、AS-2B細胞染色體不穩(wěn)定性機制研究
　　 3.1煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞姊妹染色單體分離及凝聚相關基因的影響：誘導組第30代細胞中,SMC1基因mRNA表達水平3組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義;SMC3和分離酶的基因mRNA表達水平明顯升高,保全素的基因mRNA表達水平明顯降低,與其它兩組相比差異有統(tǒng)計學意義,而其它兩組問比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　 免疫組化結(jié)果顯示,誘導組第30代細胞中,SMC1的表達水平?jīng)]

21、有改變,而SMC3和分離酶的蛋白表達水平升高,保全素蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義,而其它兩組問比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3.2煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞紡錘體檢測點相關蛋白的影響：與正常對照組和DMSO組相比較,誘導組第30代細胞Mad2,Bub1、APC基因mRNA的表達均降低。誘導組第30代細胞Mad2、Bub1和APC基因的蛋白表達都有所降低,差異具有統(tǒng)計學意義。正常對照組和DMSO組之間3種基因的mR

22、NA和蛋白表達水甲均沒有明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3.3煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞中心體的影響
　　 3.3.1中心體的改變：煤焦瀝青誘導后第10代細胞中心體存在數(shù)目和形態(tài)異常,總異常率為2.79％,高于其它兩組。但3組間比較差異無統(tǒng)計學意義。第20代細胞中心體總異常率為6.56％,主要表現(xiàn)為中心體數(shù)目異常(3.41％),明顯高于正常對照組和DMSO組,而其它兩組間的比較差異無統(tǒng)計學意義。第30代細胞

23、中心體總異常比例明顯增大(22.39％),表現(xiàn)有3種類型,包括數(shù)目異常(12.70％)、形態(tài)異常(5.69％)、數(shù)目及形狀異常(4.00％),與其余兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.3.2 P53、P21和CyclinE mRNA水平的改變：誘導組第10代細胞中P53、P21和CyclinE mRNA的變化與其它兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義;而誘導組第20代和第30代細胞中P53、P21mRNA表達量均低于其它兩組,而Cycl

24、inE mRNA表達量高于其它兩組。差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.3.3 P53、P21和CyclinE蛋白水平的改變：誘導組第10代細胞中P53、P21和CyclinE蛋白表達水平與其它兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義;而誘導組第20代和第30代細胞中P53、P21蛋白表達水平均降低,CyclinE蛋白表達水平降低高于其它兩組,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.4煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞端粒、端粒酶的影響

25、　　 3.4.1端粒長度和端粒酶活性的改變：與正常對照組和DMSO組相比較,中溫煤焦瀝青組第20代和第30代細胞端粒DNA相對長度變短、端粒酶相對活力增高差異均有統(tǒng)計學意義。而第10代正常對照組,DMSO組和中溫煤焦瀝青組相比較,各組之間各指標差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 3.4.2 POT1、TRF1和TRF2基因mRNA表達水平變化：與正常對照組和DMSO組相比較,中溫煤焦瀝青組第20代和第30代細胞POT1和TRF1基因m

26、RNA表達水平下調(diào)、TRF2基因mRNA表達水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義。而第10代3組之間各指標差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 3.4.3 POT1、TRF1和TRF2基因蛋白表達水平變化:與正常對照組和DMSO組相比較,中溫煤焦瀝青組第20代和第30代細胞POT1和TRF1蛋白表達水平降低、TRF2蛋白表達水平升高,差異均有統(tǒng)計學意義。而第10代3組之間各指標差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:煤焦瀝青煙提取物成分復雜,主