NPM基因與輻射誘導(dǎo)的染色體不穩(wěn)定性.pdf

1、輻射誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性是多級致癌理論中一個關(guān)鍵的早期事件,在致癌過程中起著重要作用。染色體不穩(wěn)定性是基因組不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式之一,是多種惡性腫瘤的普遍特征。迄今為止,國內(nèi)外對輻射誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定性的調(diào)控因子及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。因此探尋其調(diào)控的關(guān)鍵基因及其作用機(jī)制,對于闡明輻射致癌的可能機(jī)制具有重要的理論價值,同時可能為腫瘤早期診斷和治療提供新的檢測手段和治療策略。
　　 核磷蛋白(Nucleophosrnin,NPM或B23)

2、是一種多功能的核仁磷酸化蛋白,參與核糖體的裝配運(yùn)輸、DNA復(fù)制、中心體復(fù)制和有絲分裂等活動,其功能的發(fā)揮與p53狀態(tài)密切相關(guān)。它在增殖活躍的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞中呈過度表達(dá),被認(rèn)為是細(xì)胞增殖、DNA損傷后細(xì)胞存活不可缺少的關(guān)鍵基因,尤其在啟動中心體復(fù)制、維持染色體穩(wěn)定性方面起著重要的作用。目前關(guān)于NPM在輻射誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定性中的作用尚不清楚,國內(nèi)外均未見相關(guān)報道,NPM與p53的作用一直存在爭議。本研究采用不同p53狀態(tài)的人淋巴母細(xì)

3、胞系TK6(wtp53)和WTK1(mt-p53)細(xì)胞,觀察NPMmRNA和蛋白的差異表達(dá)與細(xì)胞增殖的關(guān)系,檢測NPM基因突變情況,以及在輻射誘導(dǎo)條件下NPM基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡、染色體數(shù)目變化的關(guān)系,采用Olomoucine抑制NPM蛋白磷酸化,研究NPM基因與輻射誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定性及p53的關(guān)系,對NPM的作用機(jī)制作初步的探討。研究內(nèi)容分為以下四個部分:
　　 第一部分:NPM基因在人淋巴細(xì)胞中的差異表達(dá)與細(xì)胞增殖
　　

4、 目的:研究不同p53狀態(tài)的淋巴母細(xì)胞株和人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系的增殖能力、染色體數(shù)量與NPM表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:在常規(guī)懸浮培養(yǎng)條件下,用軟瓊脂克隆形成法檢測人淋巴母細(xì)胞株TK6(wtp53)、WTK1(mtp53)和人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系的增殖能力,常規(guī)染色體分析技術(shù)檢測染色體數(shù)量的變化,同時采用RT-PCR、WestenBlot檢測NPMmRNA、總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:p53突變型WT

5、K1細(xì)胞的克隆形成能力約為p53野生型TK6細(xì)胞的2.75倍,兩者均顯著高于人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系的克隆形成能力約41倍和15倍。TK6和WTK1細(xì)胞的非整倍體率均約為54％,但TK(6細(xì)胞98％以上為整/近二倍體細(xì)胞,未發(fā)現(xiàn)有整/近四倍體及以上細(xì)胞,而WTK1細(xì)胞整/近二倍體細(xì)胞約占83％,整/近四倍體及以上細(xì)胞占11.4％。人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系(HNILL,)、TK6和WTK1細(xì)胞的NPMmRNA表達(dá)量為HNILL＜TK6

6、＜WTK1,但三者之間無顯著性差異:WTK1細(xì)胞NPM蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)顯著高于TK6細(xì)胞,兩者均顯著高于人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞。
　　 結(jié)論:p53突變型WTK1細(xì)胞與p53野生型TK6細(xì)胞、人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞相比具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力且多倍體細(xì)胞所占比例高,三種細(xì)胞的增殖能力、染色體不穩(wěn)定性與NPMmRNA、蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)呈正相關(guān),而且與p53的狀態(tài)密切相關(guān)。
　　 第二部分:NPM基因在人淋巴細(xì)胞中

7、的突變分析
　　 目的:觀察TK6和WTK1細(xì)胞是否存在累及NPM基因的5號染色體易位或NPM第12外顯子的突變情況,探討細(xì)胞增殖能力變化是否與NPM基因突變有關(guān)。
　　 方法:采用染色體G顯帶分析法檢測TK6和WTK1細(xì)胞的染色體畸變,采用雙脫氧末端終止法(Sanger法)檢測NPM第12外顯子的突變情況,與人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系和2名健康人外周血淋巴細(xì)胞相比較。
　　 結(jié)果:TK6和WTK1細(xì)胞NPM第1

8、2外顯子非編碼區(qū)存在雜合T缺失,與1名健康青年人外周血淋巴細(xì)胞的測序結(jié)果完全相同;人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞存在第12外顯子非編碼區(qū)純合T缺失,但TK6、WTK1細(xì)胞、人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞和1名健康青年人外周血淋巴細(xì)胞的NPM基因第12外顯子的編碼區(qū)均未發(fā)生突變。另1名健康青年人外周血淋巴細(xì)胞的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫序列完全一致。人正常淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系、TK6、WTK1和1名健康青年人外周血淋巴細(xì)胞染色體G帶分析均未發(fā)現(xiàn)有

9、與5號染色體相關(guān)的易位。
　　 結(jié)論:在TK6和WTK1細(xì)胞中與NPM相關(guān)的功能只與NPM基因的表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分:γ射線照射對TK6和WTK1細(xì)胞NPM表達(dá)及染色體不穩(wěn)定性的影響
　　 目的:探討輻射誘導(dǎo)的凋亡、染色體不穩(wěn)定性與NPM表達(dá)、p53之間的關(guān)系。
　　 方法:用4Gy137Csγ放射源(劑量率為0.89Gy/min)照射TK6和WTK1細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測照射后24h的細(xì)胞凋亡率

10、;常規(guī)染色體分析技術(shù)檢測照射后Oh、6h、12h、24h、48h染色體數(shù)日變化;采用RT-PCR方法檢測Oh、1h、3h、6h、12h、24hNPMmRNA表達(dá)的變化;采用WesternBlot檢測照射后Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h的NPM總蛋白及磷酸化蛋白的變化。
　　 結(jié)果:4Gyγ射線照射后24h,TK6和WTK1細(xì)胞的凋亡率均顯著高于未照射對照組,且TK6細(xì)胞的凋亡率顯著高于WTK1細(xì)胞。4Gy照射后

11、從6h開始至48h,TK6與WTK1細(xì)胞非整倍體率均明顯高于未照射對照組,從未照射時的54.3％增加至79～85％:照射后48hTK6與WTK1細(xì)胞的多倍體率明顯增加,TK6細(xì)胞由未照射時的1.4％升高到13.5％,主要為整/近三倍體從1.4％增加全10.8％,整/近四倍體從0％增加至2.7％;而WTK1細(xì)胞的多倍體率則由未照射時的17.1％升高到67％,主要表現(xiàn)為整/近四倍體從11.4％增加至48％,整/近三倍體從4.3％增加至12％

12、。TK6細(xì)胞在4Gy照射后0-24hNPMmRNA表達(dá)無明顯變化,照射后0-48hNPM蛋白及磷酸化蛋白水平亦無明顯變化,而WTK1細(xì)胞于照射后12-24hNPMmRNA表達(dá)較未照射時降低,NPM蛋白水平于照射后12-48h顯著低于未照射對照組,但磷酸化NPM蛋白于照射后12h-24h呈現(xiàn)短暫的升高后降至未照射組的水平。
　　 結(jié)論:輻射誘導(dǎo)p53突變型WTK1細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性顯著高于p53野生型的TK6細(xì)胞,而TK6細(xì)胞的

13、凋亡率明顯高于WTK1細(xì)胞,可能與γ射線誘導(dǎo)NPMmRNA、蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)及p53狀態(tài)有關(guān)。
　　 第四部分:Olomoucine對輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與染色體不穩(wěn)定性的影響
　　 目的:觀察Olomoucine抑制CDK2/cyciinE激酶活性后,對輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和染色體不穩(wěn)定的影響。
　　 方法:TK6和WTK1細(xì)胞用10μmol幾的Olomoucine處理6h后接受4Gyγ射線照射,分別于照后24h與

14、48h檢測細(xì)胞凋亡和染色體數(shù)目的變化。
　　 結(jié)果:Olomoucine使4Gy照射誘導(dǎo)的TK6和WTK1細(xì)胞的凋亡率比單純照射組顯著增加,TK6細(xì)胞由33.5％上升到43.9％,而WTK1細(xì)胞由16.8％升高到25.1％,且TK6細(xì)胞的凋亡率明顯高于WTK1細(xì)胞。照后48hOlomoucine使TK6細(xì)胞的多倍體率由單純照射的13.5％降至為0,WTK1的多倍體細(xì)胞所占比例由單純照射組的67％降至18％,恢復(fù)至未照射對照組水平