乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖、染色體不穩(wěn)定性及CCND1和chk1基因改變的研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。檢測(cè)和分析腫瘤細(xì)胞DNA含量與DNA倍體對(duì)腫瘤惡性生物學(xué)行為的判斷具有重要的價(jià)值。在乳腺癌中，非整倍體腫瘤較二倍體腫瘤生長(zhǎng)迅速，侵襲性強(qiáng)。比較基因組雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，非整倍體腫瘤較二倍體腫瘤具有更多的基因改變，包括基因重排、基因缺失、基因擴(kuò)增等。除了染色體不穩(wěn)定性外，乳腺癌腫瘤細(xì)胞的高增殖狀態(tài)與腫瘤生長(zhǎng)、演進(jìn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、死亡及化療敏感性密切相關(guān)。免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞標(biāo)記物，如

2、Ki67、各種細(xì)胞周期蛋白，能反映腫瘤細(xì)胞的增殖水平。有研究表明Ki67和cyclinA表達(dá)高與乳腺癌預(yù)后差有關(guān)。 chk1的多態(tài)性或缺陷增加了基因的不穩(wěn)定性，有助于具有突變表型的腫瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展。CCND1和chk1基因的正常對(duì)于細(xì)胞周期的正常調(diào)節(jié)和基因穩(wěn)定性有作用。利用高分辨率熒光原位雜交技術(shù)可以直觀地檢測(cè)乳腺癌石蠟標(biāo)本中CCND1和Chk1基因拷貝數(shù)的改變。 本研究分為兩部分。第一部分研究?jī)?nèi)容是分析腫瘤細(xì)胞增殖

3、活性和基因不穩(wěn)定性在乳腺癌預(yù)后中的作用。由于腫瘤存在異質(zhì)性，不同區(qū)域腫瘤細(xì)胞的增殖水平不同。為了準(zhǔn)確比較兩增殖指標(biāo)，本課題采用了連續(xù)組織切片，檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)本中Ki67和cyclinA的表達(dá)，計(jì)數(shù)相同組織學(xué)視野Ki67和cyclinA的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。將腫瘤細(xì)胞增殖水平和DNA倍體結(jié)合，同時(shí)考慮患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腫瘤大小，篩選出與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者。對(duì)378例有9年以上完整隨訪資料的乳腺癌患者進(jìn)行生存

4、曲線及Cox多因素回歸分析，探討腫瘤細(xì)胞增殖水平、DNA倍體、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與患者乳腺癌復(fù)發(fā)和死亡的關(guān)系。我們同時(shí)分析了cyclinA/Ki67比值及cyclinA細(xì)胞漿表達(dá)與乳腺癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。第二部分，我們選擇了33例浸潤(rùn)性導(dǎo)管同時(shí)伴有灶性導(dǎo)管原位癌(DCIS)分化的石蠟標(biāo)本，應(yīng)用高分辨率FISH技術(shù)檢測(cè)CCND1和Chk1基因拷貝數(shù)的改變，分析兩者與臨床病理各指標(biāo)間的關(guān)系。同時(shí)探討了cyclinD

5、1蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)的分布及與CCND1擴(kuò)增的關(guān)系。兩部分內(nèi)容結(jié)合，從不同分子水平探討了腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和基因不穩(wěn)定性與乳腺癌惡性行為和患者預(yù)后的關(guān)系。 方法：第一部分：收集瑞典卡羅林斯卡醫(yī)院1998-1999乳腺癌患者428例，其中378例有完整的9年以上隨訪資料。所有石蠟標(biāo)本4μm連續(xù)切片，免疫組化檢測(cè)Ki67、cyclinA表達(dá)情況。兩位病理醫(yī)生顯微鏡下觀察Ki67和cyclinA的表達(dá)，對(duì)每一病例選取5-14個(gè)

6、形態(tài)學(xué)相同的高倍鏡視野進(jìn)行照相，傳出到電腦。兩人分別計(jì)數(shù)Ki67和cyclinA表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于15％的腫瘤定義為高增值水平腫瘤，反之為低增殖水平腫瘤。采用Feulgen染色方法檢測(cè)乳腺癌印片標(biāo)本DNA倍體。DNA倍體主峰值在1.5c-2.5c之間且<10％的腫瘤細(xì)胞超過(guò)2.5c的腫瘤定義為二倍體腫瘤。DNA倍體主峰值位于二倍體區(qū)域之外以及DNA倍體分布超過(guò)四倍體范圍的腫瘤定義為非整倍

7、體腫瘤。SPF值通過(guò)計(jì)算DNA分布獲得。 第二部分：選擇山東大學(xué)附屬齊魯醫(yī)院手術(shù)切除乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本61例，免疫組化檢測(cè)ER、PR、Her2、Ki67、P53、cyclinD1蛋白的表達(dá)情況。高分辨率多色FISH檢測(cè)了33例伴有DCIS成分的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌石蠟切片CCND1和chkl基因拷貝數(shù)的改變。SPSSforWindowsversion15.0軟件對(duì)以上兩部分試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：1、不同組織學(xué)分級(jí)、腫瘤

8、大小分組、DNA倍體分組，Ki67和cyclinA表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在有無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，未發(fā)現(xiàn)Ki67和cyclinA表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SPF值僅在不同DNA倍體分組有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在其他分組未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、Ki67和cyclinA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，以及SPF值兩兩相關(guān)。Ki67和cyclinA的相關(guān)系數(shù)是0.9，Ki67和SPF的相關(guān)系數(shù)是0.67，cyclinA和SPF的相關(guān)系數(shù)是0.68。 3、與

9、乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的Ki67和cyclinA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分界點(diǎn)分別為15％和8％。增殖水平低的腫瘤，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的百分率分別為6.8％和7.2％；而增殖水平高的腫瘤，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的百分率分別為24.9％和27.9％。兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4、非整倍體腫瘤較二倍體腫瘤更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是T1NO腫瘤，D-tumors的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率是2-3％；A-tumors的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)20-25％。在T2NO，T1N+和T2N+腫瘤中，

10、兩組間的轉(zhuǎn)移率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5、對(duì)于腫瘤直徑小于2cm且無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤，不同增殖水平的D-tumors發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率小于4％；A-tumors發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性視腫瘤細(xì)胞的增殖情況而定，增殖水平低的A-tumors與同組的D-tumors一樣，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率較低，但增殖水平高的A-tumors，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率則接近30％，與前兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 6、對(duì)于腫瘤直徑大于等于2cm且無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的

11、腫瘤和腫瘤直徑小于2cm但有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤，無(wú)論DNA倍體如何，所有低增殖水平的的腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較T1NO腫瘤輕度增加，高增殖水平的的腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。 7、對(duì)于腫瘤直徑大于等于2cm且有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤，無(wú)論腫瘤細(xì)胞的倍體和增殖水平如何，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率均較高。 8、多因素Logistic回歸分析顯示，對(duì)于有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，腫瘤細(xì)胞增殖水平高是判斷是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的最主要危

12、險(xiǎn)因素；而對(duì)于無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，腫瘤細(xì)胞非整倍體則是最主要的危險(xiǎn)因素。 9、cyclinA/Ki67比值高的腫瘤較比值低的腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，兩組腫瘤轉(zhuǎn)移率比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尤其是在有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，cyclinA/Ki67比值高的腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。 10、Ki67或cyclinA高表達(dá)腫瘤較低表達(dá)腫瘤無(wú)復(fù)發(fā)和總的生存時(shí)間短，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在Ki67低表達(dá)組，有14.9％的患者復(fù)發(fā)，14.3％的患者死

13、亡；而在高表達(dá)組，復(fù)發(fā)率和死亡率分別為48.4％和34.6％。 11、按組織學(xué)級(jí)別、腫瘤大小和腋窩淋巴結(jié)受累情況分組，在T1、T2、NO、N+、G2+3各組腫瘤中，Ki67或cyclinA高表達(dá)較低表達(dá)腫瘤無(wú)復(fù)發(fā)和總的生存時(shí)間短，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織學(xué)Ⅰ級(jí)的腫瘤中，未發(fā)現(xiàn)上述統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 12、182例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌COX回歸分析顯示，腫瘤細(xì)胞增殖水平是判斷患者復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立的，最有意義的指標(biāo)。 13、42

14、8例乳腺癌中，85例在cyclinA細(xì)胞核表達(dá)的同時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá)，cyclinA細(xì)胞漿表達(dá)與腫瘤組織學(xué)級(jí)別高、增值水平高、非整倍體和cyclinA/Ki67比值高有關(guān)。 14、61例乳腺癌中有53例出現(xiàn)CyclinD1蛋白細(xì)胞核表達(dá)，表達(dá)率為86.9％。53例CyclinD1陽(yáng)性的病例中，11例同時(shí)伴有細(xì)胞漿CyclinD1過(guò)表達(dá)。細(xì)胞漿CyclinD1表達(dá)與細(xì)胞核CyclinD1陽(yáng)性強(qiáng)和組織學(xué)分級(jí)高有關(guān)。 15

15、、9例有CCND1擴(kuò)增的病例中，7例有明顯的細(xì)胞漿cyclinD1表達(dá)，而在24例無(wú)CCND1擴(kuò)增的病例中，僅1例有細(xì)胞漿cyclinD1表達(dá)。CCND1擴(kuò)增與細(xì)胞漿cyclinD1表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。 16、9例有CCND1擴(kuò)增的病例中，7例同時(shí)出現(xiàn)原位癌和浸潤(rùn)性癌區(qū)域的CCND1擴(kuò)增。另外兩例，僅在組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌區(qū)域有CCND1擴(kuò)增，而在低級(jí)別的DCIS區(qū)域無(wú)CCND1擴(kuò)增。cyclinD1在上述DCIS區(qū)域呈

16、細(xì)胞核弱陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)胞漿表達(dá)；而在浸潤(rùn)性癌區(qū)域cyclinD1細(xì)胞核和細(xì)胞漿均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。 17、FISH結(jié)果顯示，33例乳腺癌中10例有Chk1基因的雜合性缺失，8例Chk1缺失的乳腺癌患者同時(shí)出現(xiàn)CCND1基因的擴(kuò)增。CCND1基因擴(kuò)增和Chk1基因雜合性缺失有關(guān)聯(lián)。 結(jié)論：1、Ki67和cyclinA表達(dá)高度相關(guān)，兩者的高表達(dá)與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡早密切相關(guān)，兩者對(duì)于判斷乳腺癌患者預(yù)后具有同樣的價(jià)值。

17、 2、乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的低危險(xiǎn)組包括T1N0組的所有D-tumors和同組低增殖水平的A-tumors、T2NO和T1N+兩組所有的低增殖水平腫瘤，低轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)組腫瘤占所有腫瘤的40％，其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性小于6％。 3、乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的高危險(xiǎn)組包括所有T2N+腫瘤、除T1N0的D-tumors以外的所有高增值水平腫瘤，高轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)組發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性高達(dá)35％。 4、cyclinA胞漿表達(dá)和cyclinA/Ki