乳腺癌和癌前病變微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及錯配修復(fù)基因表達(dá)的研究.pdf

1、乳腺癌是威脅婦女最常見的惡性腫瘤，影響著近1/10女性的生命。世界范圍內(nèi)，乳腺癌的發(fā)病率不斷上升，尤其是過去發(fā)病率較低的國家增長更為明顯。乳腺癌的發(fā)生與西方的生活方式有關(guān)。在美國，乳腺癌已經(jīng)成為導(dǎo)致35-54歲年齡階段女性死亡的主要原因。在我國，隨著生活方式的改變?nèi)橄侔┌l(fā)病率目前正以3％的速度增長。研究表明，早期乳腺癌的治愈率高達(dá)80％-90％，而晚期只有40％左右。因此，深入了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找其早期階段的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，將有助

2、于乳腺癌的早期診斷和治療，從而提高治愈率和生存率。 乳腺癌的危險因素包括很多如年齡老化、低生育率、高齡生產(chǎn)、哺乳時間過短等，這些危險因素總的來說分為兩大類：過多的暴露于雌激素以及缺乏對基因組完整性的維持。最近的研究顯示，許多雌激素類似物可以直接導(dǎo)致DNA的損傷。普遍認(rèn)為乳腺癌是按照一定的順序發(fā)展而來(中間某些過程并非一定經(jīng)過)即正常乳腺上皮-增生-不典型增生-原位癌-浸潤性癌。這是一種多基因參與、多階段演進(jìn)的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程

3、。近年來的分子生物學(xué)研究表明，乳腺癌本質(zhì)上是一種基因病，和其他許多腫瘤一樣，乳腺癌的發(fā)生是多種遺傳學(xué)改變積累的結(jié)果。細(xì)胞水平的許多改變都是有序的，而遺傳學(xué)改變的積累通常是隨機(jī)的發(fā)生，有些遺傳學(xué)改變與特定的分化階段相關(guān)，而有些則與腫瘤的進(jìn)展并無關(guān)系。乳腺細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的重要遺傳學(xué)改變?；蚪M不穩(wěn)定極其復(fù)雜，由于乳腺癌的形成涉及一系列遺傳學(xué)改變，即使是微小的遺傳學(xué)差異都可能對臨床結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響。目前的研究認(rèn)為，人類腫

4、瘤的基因組不穩(wěn)定性分為兩種不同的類型：一種是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，通常是由于復(fù)制過程中DNA聚合酶錯誤導(dǎo)致；一種是染色體的不穩(wěn)定性(CIN)，也稱為雜合性缺失(LOH)，通常是由于染色體分離時的錯誤引起。本實驗對乳腺癌和癌前病變中MSI的狀態(tài)及其與乳腺癌各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行了研究。 微衛(wèi)星(microsatellite，MS)是散布于基因組中小于10個核苷酸的簡單、串聯(lián)重復(fù)序列。近年來，由于微衛(wèi)星被大量克隆定位，基因組計

5、劃研究直接提供了檢測用的探針或引物序列，加之其豐富的群體多態(tài)性，自身突變率極低等特點，使其在腫瘤的研究中得到普遍應(yīng)用。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability,MSI)指微衛(wèi)星序列的重復(fù)單位數(shù)目發(fā)生的改變。MSI除了主要發(fā)生于遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)，在許多散發(fā)性腫瘤如胃癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢癌和軟組織腫瘤均有報道。有關(guān)乳腺癌中MSI的研究結(jié)果差異較大，但是由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此很難比較不同群

6、體的結(jié)果。MSI的發(fā)生與錯配修復(fù)基因(MMR)關(guān)系密切。大量研究報道MMR基因的改變，尤其是兩個關(guān)鍵基因hMSH2和hMLH1的缺失可以導(dǎo)致許多腫瘤的MSI表型。然而也有研究認(rèn)為并非所有MSI都是由于MMR缺陷引起。為了解乳腺癌和癌前病變中MSI與MMR基因的關(guān)系，本實驗采用免疫組化法檢測了乳腺癌及癌前病變中錯配修復(fù)蛋白hMSH2和hMLH1的表達(dá)情況，并探討其與MSI和各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。 本實驗收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)

7、院病理科2002～2003年期間經(jīng)病理確診的乳腺癌和配對癌周正常組織新鮮標(biāo)本41例，乳腺癌和癌周組織經(jīng)手術(shù)切除后立即保存于-80℃低溫冰箱中。并隨機(jī)選取了13例癌前病變石蠟標(biāo)本和7例乳腺良性增生新鮮標(biāo)本進(jìn)行比較性研究。實驗內(nèi)容主要包括利用PCR-SSLP檢測三種病變的MSI狀態(tài)，并采用免疫組化法檢測hMSH2和hMLH1蛋白的表達(dá)情況，最后結(jié)合實驗結(jié)果和臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分

8、析，MSI和錯配修復(fù)蛋白表達(dá)與各臨床指標(biāo)間的關(guān)系采用行×列x2檢驗和(或)Fish's精確概率法檢驗，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。 MSI分析結(jié)果表明，41例乳腺癌中2個以上位點不穩(wěn)定15例，陽性率為36.6％，其中低分化乳腺癌MSI發(fā)生率明顯高于高中分化組(P=0.033)，而年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期等指標(biāo)與MSI無明顯關(guān)系；13例癌前病變中有9例檢測到MSI，2例(15.4％)表現(xiàn)為2個

9、以上位點不穩(wěn)定；良性增生均表現(xiàn)微衛(wèi)星穩(wěn)定。乳腺癌中微衛(wèi)星異常主要分布于D3S1766、D2S2739和TP53，而TGFβRⅡ(A)10和D17S855兩位點未檢測到不穩(wěn)定病例；癌前病變和乳腺癌具有相同的高頻不穩(wěn)定位點D3S1766和D2S2739。 免疫組化結(jié)果顯示乳腺癌的有效例數(shù)為40例。hMLH1和hMSH2蛋白在乳腺癌中陽性表達(dá)率分別為45％和40％，在癌前病變中陽性表達(dá)率分別為61.54％和76.92％，兩者均明顯低于

10、正常對照組的92.9％和100％(P＜0.05)；乳腺癌中hMSH2表達(dá)較癌前病變組明顯減弱(P＜0.05)，而hMLH1的表達(dá)在癌前病變和乳腺癌中無顯著差異(P＞0.05)；高分化癌中hMLH1、hMSH2陽性率明顯高于中低分化癌(P＜0.05)；在MSI陽性的乳腺癌中，66.7％為hMLH1陰性，73.3％為hMSH2陰性，hMLH1及hMSH2蛋白表達(dá)缺失率達(dá)100％，而MSI-L和MSS病例中表達(dá)缺失率為52％。MSI陽性癌前病

11、變中hMLH1和hMSH2同時表達(dá)缺失，相關(guān)性分析表明hMLH1和hMSH2蛋白的表達(dá)與MSI呈顯著負(fù)相關(guān)(γ=-0.507，P=0.001)。 從我們的實驗可以得出以下結(jié)論：錯配修復(fù)基因表達(dá)缺陷和MSI是乳腺癌多步驟發(fā)展過程的早期事件。在發(fā)展演進(jìn)階段，DNA修復(fù)損傷和各種重要分子事件的基因發(fā)生相互協(xié)調(diào)的變異導(dǎo)致惡性程度增加，導(dǎo)致進(jìn)展階段MSI與乳腺癌低分化相關(guān)；D3S1766和D2S2739可能是檢測乳腺癌及癌前病變MSI較敏