煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞Nrf2-Keap1-ARE通路的作用.pdf

1、煤焦瀝青(Coal tar pitch,CTP)是煤炭煉焦過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品,主要用于涂料、塑料、橡膠及煉鋼等工業(yè)中。大量流行病學資料表明,煤焦瀝青接觸者肺癌發(fā)病率明顯高于正常人群,它所引起的肺癌已經(jīng)歸為職業(yè)腫瘤。
　　煤焦瀝青煙的主要成份多環(huán)芳烴,是一種公認的致癌物。一般情況下,致癌物在生物體內的轉化依靠肝臟Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶來完成,經(jīng)Ⅰ相代謝酶(如細胞色素P450)催化后形成親電子活性致癌物,與DNA及蛋白質結合形成加合物,引

2、起癌基因和抑癌基因改變;而經(jīng)Ⅱ相代謝酶,如谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathioneS-transferase,GST)的生物轉化作用,使終致癌物親水性增強,促進其體外排泄。這些Ⅱ相代謝酶的協(xié)同誘導反應通過靶基因調控區(qū)稱為抗氧化反應元件(ARE)或親核反應元件(EpRE)的順式作用元件調控。Nrf2-Keap1/ARE信號通路的激活可以誘導一系列內源性抗氧化酶和抗氧化蛋白的表達,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮“雙刃劍”功能,在正常狀態(tài)或亞

3、毒性劑量的刺激下,Nrf2-Keap1/ARE通路調節(jié)Ⅱ相代謝酶表達,使細胞免受氧化損傷;但在腫瘤細胞中,Ⅱ相代謝酶表達作用不受抑制,增加了腫瘤細胞對氧化應激的耐受和增殖能力,從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。
　　因此Nrf2-Keap1/ARE通路成為氧化應激、癌癥預防等領域的研究熱點。Nrf2-Keap1系統(tǒng)在細胞抵御外源性或內源性氧化應激的機制中占有重要地位。Nrf2缺失和激活障礙與化合物致癌、藥物性肝損傷、炎癥修復延遲、細胞凋亡

4、等病變過程相關。目前認同的Nrf2激活機制包括Nrf2與Keap1的解耦連、蛋白酶對Nrf2的降解減弱、Nrf2磷酸化等。隨著對Nrf2-Keap1在細胞應激保護、損傷修復等諸多方面認識的深入及作用機制的了解,Nrf2-Keap1將為抗腫瘤、抗炎癥治療提供新的思路。在哺乳動物中,Nrf2-Keap1/ARE通路是細胞抗氧化反應的中樞調節(jié)者。Nrf2通過與ARE相互作用調節(jié)抗氧化蛋白和代謝酶的表達,因此該通路是癌癥化學預防的研究熱點。

5、r>　　研究用不同濃度的煤焦瀝青煙提取物染毒人支氣管上皮細胞(BEAS-2B),從mRNA水平上分析其對BEAS-2B細胞表達Nrf2、Keap1和NQO1的影響,Western blotting驗證其對Nrf2蛋白的影響。探討Nrf2-Keap1/ARE通路在煤焦瀝青煙提取物致細胞氧化損傷中的作用,為進一步研究煤焦瀝青致癌及預防提供理論依據(jù)。
　　方法:1.煤焦瀝青煙提取物的制備和對細胞增殖的影響。400℃加熱煤焦瀝青,粉塵采樣

6、器收集產(chǎn)生煙氣,乙酸乙酯溶解纖維素膜上的煤焦瀝青煙顆粒,揮發(fā)濃縮后,用二甲基亞砜溶解,氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用技術分析其成分。用其染毒BEAS-2B細胞,分析對該細胞增殖的影響。2.煤焦瀝青煙提取物對Nrf2、Keap1和NQO1基因轉錄的影響。以煤焦瀝青煙提取物0.00、1.25、2.50、5.00、10.00μg/ml染毒BEAS-2B細胞24h,提取總RNA,進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),以GADPH為內參照,檢

7、測Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表達水平。3.煤焦瀝青煙提取物對Nrf2蛋白表達的影響。以0.00、1.25、2.50、5.00、10.00μg/ml染毒濃度干預BEAS-2B細胞24h,提取總蛋白,Western blotting檢測蛋白表達情況,以β-acting為內參照,半定量測定Nrf2蛋白的表達。4.統(tǒng)計分析。運用SPSS12.0統(tǒng)計軟件,Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗、Levene方差齊性檢驗、單

8、因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(檢驗水準α=0.05)。
　　結果:1.煤焦瀝青煙提取物經(jīng)GC-MS分析,主要成分為稠環(huán)芳烴類,用該提取物染毒BEAS-2B細胞24h,MTT檢測細胞活性,結果顯示染毒濃度為1.25μg/ml時,刺激細胞的增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),2.50μg/ml~10.Oμg/ml之間,抑制細胞的增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.煤焦瀝青煙提取物以0.00、1.25、2.50、5.00、

9、10.00μg/ml染毒BEAS-2B細胞24h,①染毒組Nrf2 mRNA及蛋白相對表達量低于對照組,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),②實驗組Keap1 mRNA表達量比對照組高,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③NQO1 mRNA相對表達量方差分析結果顯示5.00、10.00μg/ml NQO1基因相對表達量比對照高,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),隨著染毒濃度的增加,NQO1基因的表達有增加的趨勢。
　　結論:1.不同

10、劑量的煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞的增殖產(chǎn)生截然不同的結果,低濃度時(1.25μg/ml)可刺激細胞的增殖,高濃度時(2.5、5.0、10.00μg/ml)可顯著地抑制細胞的增殖,隨劑量增加抑制作用增強;2.隨著煤焦瀝青煙提取物染毒濃度的增加,Nrf2 mRNA和蛋白表達呈遞增趨勢,Keap1基因mRNA表達量逐漸降低,NQO1基因表達量隨著染毒濃度的增加而增加,提示BEAS-2B細胞可能通過Nrf2-Keap1通路調節(jié)下游NQ