煙草煙霧冷凝物和大氣細(xì)顆粒物對BEAS-2B細(xì)胞的毒性及機(jī)制研究.pdf

1、目的:利用體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)，觀察并比較兩種空氣顆粒物煙草煙霧冷凝物(CSC)和天津市大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)對BEAS-2B細(xì)胞的毒性效應(yīng)，揭示相關(guān)毒作用機(jī)制，為預(yù)防和控制兩種典型空氣顆粒物所致呼吸系統(tǒng)疾病提供科學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.兩種顆粒物染毒液的制備和處理:CSC:選用3R4F參比卷煙為樣品。按GB/T5606.1-2004的規(guī)定取樣，捕集煙草煙霧冷凝物并調(diào)整濃度得10mg/ml的C

2、SC樣品母液，-80℃保存?zhèn)溆谩M2.5:利用嶗山2030型中流量智能TSP采樣器的第三級采集細(xì)顆粒物，隨后進(jìn)行超聲洗脫處理，制成細(xì)顆粒物干粉，配成終濃度為100mg/ml的細(xì)顆粒物母液，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.利用CCK-8法檢測不同濃度顆粒物對BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響，明確CSC和PM2.5的半數(shù)抑制濃度并確定后續(xù)實驗的干預(yù)劑量;利用倒置顯微鏡觀察兩種顆粒物對BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)的影響;采用AnnexinⅤ-FI

3、TC/PI雙染試劑盒，利用流式細(xì)胞儀分析兩種顆粒物對細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.利用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測顆粒物暴露后BEAS-2B細(xì)胞裂解液中MDA含量、GSH、8-OHdG表達(dá)水平以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD水平，明確顆粒物暴露導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng);利用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測顆粒物暴露后BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的含量，明確顆粒物暴露導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。
　　4.利用定制的凋

4、亡抗體芯片RayBio(@) Human Apoptosis Antibody ArrayG1高通量篩選CSC和PM2.5誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞凋亡時涉及的凋亡蛋白，并利用RT-PCR和Western blotting方法對差異的凋亡蛋白及其所在通路蛋白進(jìn)行驗證。
　　5.利用定制的炎癥抗體芯片RayBio(@) Human Inflammation AntibodyArray G SeriesⅢ篩選PM2.5暴露導(dǎo)致BEAS-2

5、B細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的變化，并利用ELISA方法對差異炎癥因子及其所在通路進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果:
　　1、CSC和PM2.5的成分分析。CSC中共檢測出13種多環(huán)芳烴類有機(jī)物，含量由多到少依次為:蒽(18.99％)、苯并蒽(11.57％)、苯并k熒蒽(8.52％)、苯并b熒蒽(8.29％)、屈(8.17％)、菲(6.97％)、苯并苝(6.83％)、茚并芘(5.13％)、芘(3.57％)、二苯并蒽(3.53％)、熒蒽(3.23

6、％)、芴(2.13％)、苯并芘(0.81％);另外檢出5種重金屬類物質(zhì)，含量由多到少依次為:Zn(8.86％)、Cu(2.65％)、Cd(0.44％)、Mn(0.22％)、Hg(0.09％)。PM2.5中共檢測出11種多環(huán)芳烴類有機(jī)物，含量由多到少依次為:苯并b熒蒽(6.50％)、苯并k熒蒽(5.62％)、屈(4.71％)、苯并芘(4.53％)、苯并苝(4..05％)、苯并蒽(3.92％)、熒蒽(3.87％)、茚并芘(3.21％)、芘(

7、2.82％)、菲(0.69％)、蒽(0.26％);另外檢出8種重金屬類物質(zhì)，含量由多到少依次為:Zn(28.95％)、Pb(11.47％)、Mn(9.80％)、Cu(9.29％)、Cr(0.13％)、Ni(0.13％)、Cd(0.06％)、Hg(0.002％)。
　　2、CSC和PM2.5對BEAS-2B細(xì)胞的毒性效應(yīng)
　　(1)根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果得出CSC對BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為80μg/ml

8、，即設(shè)置CSC染毒劑量為（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）;PM2.5對BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為165μg/ml，因此設(shè)置PM2.5染毒劑量為（0μg/ml、17.5μg/ml、35μg/ml、70μg/ml）。
　　(2) BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)CSC暴露24h，可見細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。與對照組相比，細(xì)胞胞漿疏松，觸角變狹長，彼此連接減少，細(xì)胞整體變細(xì)長瘦弱，透明度下降，并有不

9、同程度的死亡細(xì)胞。而PM2.5暴露后，BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)的改變是細(xì)胞之間空隙加大，生長密度降低，漂浮細(xì)胞增多。隨著PM2.5濃度的增加，晃動培養(yǎng)液，漂浮細(xì)胞增多，并且可以觀察到細(xì)胞中存在顆粒狀物質(zhì)。
　　(3) BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)CSC處理24h后，在AnnexinⅤ-FITC/PI散點圖上可見隨著CSC濃度的增加，位于右下和右上象限的早凋和晚凋細(xì)胞逐漸增多，且與對照組相比，BEAS-2B細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組;而BEA

10、S-2B細(xì)胞經(jīng)PM2.5處理24h后，在AnnexinⅤ-FITC/PI散點圖上可見隨著PM2.5濃度的增加，位于左上和右上象限的細(xì)胞膜破損和晚凋細(xì)胞逐漸增多，且與對照組相比，BEAS-2B細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組。
　　(4) BEAS-2B細(xì)胞在CSC的刺激下，各處理組EC-SOD、MDA、8-OHdG水平顯著高于對照組，而GSH水平顯著低于對照組，結(jié)果表明CSC可通過氧化應(yīng)激方式對BEAS-2B細(xì)胞造成毒性損傷;而BEAS

11、-2B細(xì)胞在PM2.5的刺激下，中、低劑量組的EC-SOD、MDA、8-OHdG水平升高緩慢，但在高劑量組則極顯著高于對照組，而GSH水平顯著低于對照組，結(jié)果表明PM2.5可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并不明顯。
　　(5) BEAS-2B細(xì)胞在CSC的刺激下，各處理組TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8水平顯著高于對照組，結(jié)果顯示CSC可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng);而BEAS-2B細(xì)胞在PM2.5的刺激下，各處理組TN

12、F-α，IL-1β，IL-6，IL-8水平極顯著高于對照組，結(jié)果顯示PM2.5可導(dǎo)致細(xì)胞免疫炎癥水平升高，釋放大量炎性介質(zhì)，從而造成細(xì)胞損傷。
　　3、CSC和PM2.5引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　(1) CSC蛋白芯片及Western blotting實驗結(jié)果顯示BEAS-2B細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白TNF-R1、p21、IGF-1R、PI3K、AKT表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)asL表達(dá)水平顯著降低，由此推測IGF-1R/PI

13、3K/AKT通路可能是引發(fā)CSC暴露BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并死亡的作用機(jī)制。
　　(2) PM2.5凋亡抗體芯片、RT-PCR和Western blotting實驗結(jié)果均顯示BEAS-2B細(xì)胞在PM2.5的刺激下，相關(guān)凋亡蛋白TNF-R1、Fas、HTRA、BID、Caspase8表達(dá)水平顯著升高，IGF-2、TNF-R2表達(dá)水平顯著降低。
　　4.PM2.5引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。PM2.5芯片結(jié)果顯

14、示炎癥因子IL-8、IL-13、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-17、TGF-b1、IP-10、1-309、IL-4、EOTAXIN、IL-3、EOTAXIN-2表達(dá)升高，炎癥因子TIMP-2、IL-10表達(dá)降低。利用KEGG數(shù)據(jù)庫和ELISA方法驗證結(jié)果顯示IL-4、IL-13、Eotaxin、TNF-α、IL-3等相關(guān)炎癥因子的表達(dá)升高激活哮喘相關(guān)通路最終導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)引起支氣管損傷。
　　結(jié)論:

15、
　　1、CSC和PM2.5在所包含的物質(zhì)成分及各成分含量上均存在差異。在多環(huán)芳烴類物質(zhì)方面:CSC中主要檢出13種多環(huán)芳烴類物質(zhì)，含量占前三位的分別是:蒽、苯并蒽、苯并k熒蒽，而PM2.5中主要檢測出11種多環(huán)芳烴類物質(zhì)，含量占前三位的分別是:苯并b熒蒽、苯并k熒蒽、屈。在重金屬類物質(zhì)方面:CSC中主要檢出5種重金屬類物質(zhì)，含量占前三位的分別是:Zn、Cu、Cr，而PM2.5中主要檢出8種重金屬類物質(zhì)，含量占前三位的分別是:Zn

16、、Pb、Mn。
　　2、CSC和PM2.5對BEAS-2B細(xì)胞的毒性效應(yīng)存在差異。CSC對BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為80μg/ml，PM2.5對BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為165μg/ml，可見CSC對BEAS-2B細(xì)胞的毒性大于PM2.5;CSC導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞變狹長瘦弱，PM2.5則可導(dǎo)致細(xì)胞回縮變形并且可在細(xì)胞中觀察到顆粒狀物質(zhì)，可見CSC導(dǎo)致BEAS-2B發(fā)生形態(tài)學(xué)變化與PM

17、2.5存在差異;CSC和PM2.5均可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而CSC致BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)水平顯著高于PM2.5，PM2.5則主要是通過炎癥反應(yīng)作用于BEAS-2B細(xì)胞。
　　3、CSC和PM2.5誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞凋亡機(jī)制不同。CSC可以通過TNF-R1、p21、IGF-1R的表達(dá)升高引發(fā)BEAS-2B細(xì)胞凋亡，并通過促進(jìn)IGF-1R表達(dá)升高激活下游PI3K及AKT蛋白導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)