城市道路周邊大氣超細顆粒物對體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞的毒性研究.pdf

1、目的：
　　我國城市空氣污染問題日益嚴重，大氣顆粒物中包含大量超細顆粒物（ultrafine particles，UFPs），以往流行病學(xué)研究提示，超細顆粒物與神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在關(guān)聯(lián)，長期生活在顆粒物污染地區(qū)會導(dǎo)致認知功能的下降。城市道路附近空氣中的UFPs濃度較高，與城市道路相關(guān)的職業(yè)人群比其他人群接觸UFPs的時間更長、濃度更高，這類人群的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)更易受到UFPs的危害。本研究采集城市道路周邊空氣中的UFPs，對體

2、外培養(yǎng)的人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(U251)細胞進行染毒，觀察不同濃度下UFPs對U251的細胞毒性，并從細胞氧化應(yīng)激水平、線粒體功能、細胞凋亡水平這幾方面初步探討UFPs對CNS的毒作用機制，為城市道路空氣污染對相關(guān)職業(yè)人群及其他密切接觸人群CNS影響的研究提供實驗依據(jù)及理論參考。
　　方法：
　　1.UFPs采集
　　在某市機動車流量較大的交通干道旁設(shè)置采樣點，使用DLPI-30撞擊式多級顆粒物采樣器采集UFPs。
　

3、　2.UFPs懸浮液的制備
　　稱取適量UFPs放于玻璃瓶中，高壓蒸汽滅菌(121℃，30min)，烘干后加入適量培養(yǎng)基，配制成終濃度為640μg/ml的母液，臨用前超聲30min使UFPs充分混懸，用培養(yǎng)基逐級稀釋至染毒所需濃度。
　　3.CCK-8法檢測細胞存活率
　　U251細胞經(jīng)UFPs染毒48h后，加入CCK-8試劑，充分混勻。37℃孵育60min后于酶標(biāo)儀450nm處測定吸光度，實驗重復(fù)三次。
　　4

4、.氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定
　　U251細胞經(jīng)UFPs染毒48h后，利用專用檢測試劑盒分別測定細胞T-SOD活力、GSH含量、總抗氧化能力(T-AOC)和MDA含量。
　　5.線粒體膜電位(MMP)測定
　　采用JC-1法測定U251細胞內(nèi)線粒體膜電位，分別使用熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀觀察檢測染毒前后熒光強度的變化，根據(jù)各劑量組紅綠熒光強度比值，測定其線粒體內(nèi)膜去極化程度。
　　6.ATP含量的測定
　　U251細胞經(jīng)

5、UFPs染毒48h后，利用專用檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ATP含量。
　　7.細胞凋亡的檢測
　　用流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測不同濃度UFPs作用48h后對U251細胞凋亡水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.UFPs對U251細胞存活率的影響
　　隨著UFPs濃度的增加，細胞存活率逐漸降低。與0μg/ml劑量組比較，各劑量組細胞存活率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　

6、2.UFPs對U251細胞氧化應(yīng)激水平的影響
　　UFPs作用于U251細胞48h后，各劑量組氧化應(yīng)激指標(biāo)均有改變。與0μg/ml劑量組相比，20μg/ml、40μg/ml劑量組T-AOC含量降低;10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml劑量組T-SOD含量降低，MDA含量升高;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與0μg/ml劑量組相比，各劑量組GSH含量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.UF

7、Ps對U251細胞線粒體膜電位的影響
　　UFPs作用于U251細胞48h后，熒光顯微鏡下觀察到線粒體膜電位發(fā)生改變。隨著UFPs濃度的增加，線粒體膜電位逐漸降低，與0μg/ml劑量組相比，10μg/ml劑量組線粒體膜電位無明顯變化;20μg/ml、40μg/ml劑量組線粒體膜電位顯著降低(P＜0.05)。
　　4.UFPs對U251細胞ATP含量的影響
　　隨著UFPs濃度的升高，細胞內(nèi)ATP含量逐漸降低。與0μg/

8、ml劑量組比較，僅40μg/ml劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.UFPs對U251細胞凋亡的影響
　　UFPs作用于U251細胞48h后，各劑量組隨著UFPs濃度的增加，細胞凋亡率逐漸提高;20μg/ml、40μg/ml劑量組細胞凋亡率與0μg/ml劑量組比較分別增加了1.6％和6.85％，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各劑量組早期細胞凋亡率普遍高于晚期細胞凋亡率，二者均隨UFPs濃度的升高而升高;