香煙煙霧提取物中的尼古丁對穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞的毒效應(yīng)影響.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有約11億人吸煙，15歲以上男性的吸煙率超過30％，女性超過6％，因此，煙草仍然是世界人口健康的威脅。中國是煙草消費(fèi)大國，目前男性的吸煙率為47％、女性為2％，但二手煙暴露的比例都接近50％，吸煙造成每年約630萬人死亡。香煙煙霧是人類最常接觸的外源有害因素，可引起人體廣泛損害。在吸煙相關(guān)疾病導(dǎo)致的死亡中，心血管疾病占40％、肺癌占20％、慢性阻塞性肺炎占20％、其它占20％，形勢十分嚴(yán)峻。吸煙引起的腫瘤備受關(guān)注，尤其吸煙與

2、肺癌有關(guān)。吸煙導(dǎo)致肺癌已廣為人知，我國人群的肺癌一半因吸煙而起。據(jù)報(bào)道，香煙煙霧中有超過5000種的化合物，已經(jīng)確定的致癌化合物多達(dá)60種，主要包括多環(huán)芳烴（如苯并芘）、亞硝胺和芳香胺等。通常情況下，這些致癌物質(zhì)多為前致癌物，需要生物轉(zhuǎn)化過程中的Ⅰ相代謝酶(主要為細(xì)胞色素P450酶，CYP)的代謝激活才能發(fā)揮致癌作用。CYP2A13是近年發(fā)現(xiàn)的一種主要在呼吸系統(tǒng)表達(dá)的肝外代謝酶，主要分布在氣管和支氣管的上皮細(xì)胞，在氣管和支氣管的平滑肌細(xì)

3、胞也有少量表達(dá)。我們近年來的研究表明，CYP2A13可以代謝AFB1，其介導(dǎo)的代謝活化在AFB1所致細(xì)胞毒性、DNA加合物形成、DNA損傷、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。人群研究也證實(shí)，低活性的CYP2A13變異體（R257C）能夠降低肺癌（腺癌）發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。CYP2A13與香煙煙霧致癌物的代謝有關(guān)，4-（甲基亞硝胺基）-卜（3-吡啶基）-1-丁酮(NNK)是香煙煙霧中最著名的一種肺致癌物，CYP2A13在肺部代謝活化NN

4、K中起了關(guān)鍵作用。香煙煙霧中存在多種其它CYP2A13酶的底物，例如，尼古丁、苯并芘、萘、3-甲基吲哚(3-MI)等。由于尼古丁在香煙煙霧中的含量較高，其本身以及被CYP2A13代謝后的產(chǎn)物毒性低，因此，在香煙煙霧化合物中，尼古丁可能通過大量消耗CYP2A13酶，而影響代謝含量較低的化合物如NNK、苯并芘、萘、3-甲基吲哚等的活性，從而影響或掩蓋了CYP2A13對香煙煙霧的代謝及其毒效應(yīng)的評價。因此，通過去除尼古丁，可以有效地再現(xiàn)CYP

5、2A13對低含量的有毒物質(zhì)（尤其是間接致癌物）的代謝活性，為深入探討CYP2A13在原位代謝香煙煙霧所致呼吸系統(tǒng)損傷和肺癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。迄今，未見相關(guān)的研究報(bào)道。本研究采用自制的吸煙裝置，通過比較分析選取吸收效率較高的溶劑作為吸收液，制備香煙煙霧提取物(CSE)，對代表物質(zhì)尼古丁和NNK進(jìn)行了定性和定量分析;采用高效液相色譜分離去除CSE中的尼古丁，并對比了CSE、CSE中的尼古丁部分和CSE中非尼古丁部分對穩(wěn)定表達(dá)CYP2A1

6、3的人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞(B-2A13)以及空載支氣管上皮細(xì)胞(B-V)的毒作用差異。初步探討尼古丁對CYP2A13代謝活化CSE化合物的影響，為深入闡明CYP2A13在香煙煙霧所致呼吸系統(tǒng)損傷的作用提供線索。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：CSE制備及尼古丁分離。
　　目的：選擇一種吸收效率較強(qiáng)的溶劑制備CSE，利用超高壓液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC/MS)對CSE中尼古丁和NNK的含量進(jìn)行檢測。利用高效液相色

7、譜法確定CSE樣品中尼古丁的位置并進(jìn)行分離，獲得CSE尼古丁部分(CSE-N)和CSE非尼古丁部分(CSE-O)。為后續(xù)評價尼古丁對CYP2A13代謝CSE的活性評價提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　方法：⑴香煙煙霧抽吸裝置的組裝及儀器穩(wěn)定性檢驗(yàn)。參考資料組裝簡易的香煙煙霧抽吸裝置，設(shè)定大氣采樣器流速75 mL/min，每支煙的燃燒時間控制在5min左右;檢測吸收液處理前和處理后含量的變化以觀察結(jié)果的穩(wěn)定性。⑵吸收液的確定。選擇四種有代表性的溶

8、劑作為備選吸收液，采用預(yù)先設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，每次抽吸3支香煙;在相同條件下，利用高效液相色譜對各吸收液的進(jìn)行檢測，并結(jié)合尼古丁的最佳波長，確定一種吸收效果較好的溶劑作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的吸收液。⑶CSE制備及質(zhì)量控制和尼古丁、NNK檢測。按照確定的實(shí)驗(yàn)方法制備CSE:大氣采樣器流速75 mL/min，串聯(lián)兩個多孔玻板吸收管，每個吸收管中加入10 mL吸收液，每次抽吸3支煙;將吸收液濃縮至3支/mL作為CSE樣品的儲備液。為了檢驗(yàn)樣品濃縮過程的

9、穩(wěn)定性，分別在濃縮前、后利用超高壓液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC/MS)檢測尼古丁、NNK含量，評價樣品在濃縮過程中的穩(wěn)定性。⑷CSE中尼古丁的確定及分離。通過不斷優(yōu)化高效液相色譜方法，使CSE中的各物質(zhì)峰盡量分離。通過與尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品的相對保留時間比對，確定CSE色譜圖中尼古丁峰的吸收峰位置，對尼古丁出峰位置及附近的物質(zhì)進(jìn)行收集，作為CSE的尼古丁部分(CSE-N);其余的收集在一起，作為CSE的非尼古丁部分(CSE-O)。
　　結(jié)果

10、：①吸收波長的確定。根據(jù)DU800型分光光度計(jì)在測定尼古丁在200-500nm掃描波長下的吸收，確定260 nm作為尼古丁及吸收液的檢測波長。②吸收液的確定。當(dāng)用高效液相色譜測定各吸收液在260 nm波長下的吸收情況，分析發(fā)現(xiàn)，相對于水、正己烷和甲醇，二氯甲烷作吸收液時，色譜圖上出現(xiàn)更多的物質(zhì)峰;扣除溶劑空白的峰面積后，其色譜圖上物質(zhì)的峰面積和也是最大的(p＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，二氯甲烷對香煙煙霧的吸收溶解能力相對較強(qiáng)。綜合上述，

11、選擇二氯甲烷作吸收液能夠達(dá)到對香煙煙霧更好的吸收效率。③CSE制備及質(zhì)量控制和尼古丁和NNK檢測。CSE經(jīng)超高壓液相和質(zhì)譜(U-HPLC/MS)分析檢測，其中的尼古丁含量為103.655±17.336μg/支，NNK含量為12.708±3.823ng/支;濃縮之后NNK含量為12.332±4.823328ng/支，尼古丁含量為97.763.20±17.158μg/支。結(jié)果表明，溶液穩(wěn)定性較高，損失較少。④CSE中尼古丁位置確定及分離。高

12、效液相色譜法檢測尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品得出，尼古丁的相對保留時間為20.208min。將CSE分成尼古丁部分(CSE-N)和非尼古丁部分(CSE-O)后，再用高效液相色譜分別檢測兩部分的尼古丁，發(fā)現(xiàn)CSE-O在20-23 min內(nèi)沒有明顯的物質(zhì)峰;而對于CSE-N，用優(yōu)化的高效液相色譜法分析，CSE-N色譜圖上存在與尼古丁保留時間相同的峰。
　　第二部分：CSE中的尼古丁對其所致B-2A13細(xì)胞毒性的影響。
　　目的：通過比較經(jīng)CSE

13、、CSE-N和CSE-O處理的B-2A13和B-V細(xì)胞的毒效應(yīng)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷的差異，初步闡述尼古丁在CYP2A13代謝CSE及其致細(xì)胞損傷中的作用，為深入探討CYP2A13在香煙煙霧引起呼吸系統(tǒng)損傷中的作用及相關(guān)的防治措施提供線索，也為吸煙的健康損害評價、控?zé)煵呗灾贫ǖ忍峁├碚撘罁?jù)。
　　方法：⑴尼古丁、NNK對B-2A13和B-V細(xì)胞毒效應(yīng)。將濃度為0、1、10、100、1000μM尼古丁和濃度為0、0.1、1、10、1

14、00μM NNK處理B-2A13和B-V細(xì)胞24h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。⑵CSE、CSE-N和CSE-O對B-2A13和B-V細(xì)胞的毒效應(yīng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分別用體積百分比為0％、3.33％(1/30)、5％(1/20)、10％(1/10)和20％(1/5)的CSE和CSE-N，以及0％、0.5％、1％和2％的CSE-O處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h;此外，用CSE-O與1μM8-MOP聯(lián)合處理B-2A13細(xì)胞24 h

15、后，CCK-8法檢測細(xì)胞活性。⑶CSE、CSE-N和CSE-O對B-2A13和B-V細(xì)胞的凋亡作用。用5％CSE、10％C SE-N和2％CSE-O處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的凋亡情況，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞的凋亡。⑷CSE、CSE-N和CSE-O對B-2A13和B-V細(xì)胞凋亡和DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。用5％CSE、10％CSE-N和2％CSE-O處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h，提

16、取各細(xì)胞的總蛋白，采用免疫印跡法檢測部分凋亡蛋白及DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：①尼古丁、NNK對B-2A13和B-V細(xì)胞的毒效應(yīng)。1000μM的尼古丁處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h后，兩種細(xì)胞的活性均未明顯改變;100μM濃度的NNK處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h后，B-2A13細(xì)胞活性下降至50％，B-V細(xì)胞的活性也下降至80％，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，顯示CYP2A13在代謝活化NNK所致的細(xì)胞毒作用

17、中發(fā)揮了重要作用。②CSE、CSE-N和CSE-O對B-2A13和B-V細(xì)胞的毒效應(yīng)。不同濃度CSE處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h后，兩種細(xì)胞的毒效應(yīng)均呈現(xiàn)劑量依賴性增加;在相同濃度下，兩者之間的細(xì)胞活性差異不明顯。用不同濃度CSE-N處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h后，B-2A13細(xì)胞在0-10％濃度的CSE-N處理后表現(xiàn)出少量的生長或增殖;而B-V細(xì)胞的活性都在100％以上，表現(xiàn)為微弱的增殖效應(yīng)。不同濃度的CSE-O處理B

18、-2A13和B-V細(xì)胞24 h后，兩種細(xì)胞的活性都表現(xiàn)為濃度的依賴性的降低，而B-2A13細(xì)胞的活性下降更顯著，兩種細(xì)胞的活性在1％-4％的濃度下均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8-MOP可抑制CSE-O所致的B-2A13細(xì)胞的毒性作用，使B-2A13細(xì)胞活性部分恢復(fù)，接近B-V細(xì)胞的活性。結(jié)果提示CSE和CSE-N對兩種細(xì)胞的毒性效應(yīng)基本沒有差異，但CSE-O對B-2A13細(xì)胞的毒性要明顯且受強(qiáng)于B-V細(xì)胞且受8-MOP的抑制，提示CSE中的尼古丁可

19、影響CYP2A13對CSE的代謝毒性。③CSE、CSE-N和CSE-O對B-2A13和B-V細(xì)胞的凋亡作用。5％CSE、10％CSE-N和2％CSE-O處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀與Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均顯示，相對于空白組，5％CSE處理24h可使兩種細(xì)胞都出現(xiàn)近50％的凋亡;10％CSE-N處理24 h，兩種細(xì)胞的凋亡率也沒有出現(xiàn)明顯增加;當(dāng)用2％CSE-O處理24 h后，B-2A13細(xì)胞出現(xiàn)了2

20、0％左右的凋亡，而B-V細(xì)胞的凋亡率約為8％，接近于空白對照組。兩種細(xì)胞之間出現(xiàn)了明顯的差異，提示CSE中的尼古丁可影響CYP2A13代謝CSE后產(chǎn)生的凋亡作用。④CSE、CSE-N和CSE-O所致B-2A13和B-V細(xì)胞凋亡和DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。5％CSE、10％CSE-O和2％CSE-N處理B-2A13和B-V細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中出現(xiàn)了凋亡與DNA損傷修復(fù)的分子過程;CSE-O處理的B-2A13細(xì)胞中C-Caspase3

21、、p-p53、p-Chk1、γ-H2AX、XLF蛋白表達(dá)量比B-V細(xì)胞更加明顯;CSE-N處理對上述蛋白的表達(dá)影響不明顯。結(jié)果提示，尼古丁可通過影響凋亡與DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)而影響CYP2A13代謝CSE所致的細(xì)胞毒效應(yīng)。
　　結(jié)論：⑴在水、正己烷、甲醇和二氯甲烷四種溶劑中，二氯甲烷對香煙煙霧的吸收能力最好，可作為CSE制備的吸收液。在本實(shí)驗(yàn)的條件下，采用超高壓液相色譜和質(zhì)譜（UHPLC-MS）檢測CSE樣品中尼古丁含量為

22、103.655±17.336μ g/支，NNK含量為12.708±3.823ng/支。⑶根據(jù)尼古丁的相對保留時間，可以將尼古丁從CSE中有效的分離出來，獲得含有尼古丁的CSE(CSE-N)和不含有尼古丁的(CSE-O)部分。與CSE和CSE-N相比，CSE-O對B-2A13細(xì)胞的毒性效應(yīng)要明顯B-V細(xì)胞，且上述效應(yīng)可以被CYP酶的抑制劑8-MOP所抑制;相關(guān)的蛋白表達(dá)改變也存在差異。⑷CSE中的尼古丁可干擾CYP2A13對CSE中非尼古