香煙煙霧致BEAS-2B細胞惡性轉化中相關基因表達及啟動子甲基化改變.pdf

1、目的:建立香煙煙霧致體外人支氣管上皮細胞惡性改變的細胞模型,研究香煙煙霧染毒誘發(fā)人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)惡性轉化中相關基因表達情況和RASSF1A、MGMT、p16、APC、DAPK-1等基因啟動子甲基化狀況,探索吸煙致肺癌發(fā)生機制,為吸煙致肺癌防治提供理論依據(jù)。
　　 方法:將處于對數(shù)生長期的:BEAS-2B細胞以1×105接種于Transwell培養(yǎng)皿中,細胞貼壁后將Transwell培養(yǎng)皿置于細胞氣體染毒裝置中染

2、毒,培養(yǎng)基霧化泵入維持細胞生存環(huán)境,氧氣濃度恒定于21％,水浴維持染毒腔溫度在37℃。CCK-8法檢測染煙后細胞增殖抑制率確定染煙濃度及時間,獲得合適染毒濃度和染毒時間后進行正式染毒。染煙兩次后將Transwell培養(yǎng)皿中細胞消化下置于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng),待生長至對數(shù)生長期后進行下一代染煙,共染煙40代。對照組暴露于煙霧濃度為0％的相同裝置中,其余條件同染煙組。比較對照組細胞、染煙5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40

3、代細胞的一般生物學狀況(生長狀況、細胞形態(tài)學、細胞周期和細胞凋亡率),血清抗性實驗、錨著獨立性生長實驗等細胞惡性轉化指標。對照組和各染毒組細胞再各傳至20代時RT-PCR.后檢測各組p16、Survivin和bcl-2基因mRNA的表達水平。以甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測處于惡性轉化各階段中RASSF1A、MGMT、p16、DAPK-1、APC基因啟動子特異位點的甲基化狀況；同時檢測RASSF1A、MGMT基因mRNA表達情況。

4、
　　 結果:(1)細胞染煙模型的建立。在染煙時間相同條件下,隨染煙濃度升高,細胞增殖抑制率逐漸增加；在煙霧濃度相同條件下,隨染毒時間延長,細胞增殖抑制率逐漸增加,最后確定染毒濃度和時間為20％,10min。隨染煙代數(shù)的增加,人支氣管上皮細胞BEAS-2B可發(fā)生惡性轉化,表現(xiàn)為形態(tài)學和生長特性變化,細胞呈現(xiàn)異形性,核質(zhì)比例增大,核仁大而多；細胞間失去接觸抑制,呈復層重疊生長,細胞傳代周期由4d縮短為2d；至染煙40代細胞融合率可

5、達100％,而對照組細胞融合率達到80％后即出現(xiàn)生長停滯情況。隨染煙代數(shù)的增加,細胞形態(tài)學及生長趨于穩(wěn)定,表現(xiàn)出類似癌細胞的生長特性。各染煙組細胞G1期百分比明顯減少,增殖指數(shù)明顯升高,表明細胞處于增殖旺盛狀態(tài),其周期發(fā)生一定程度的失控,同時細胞凋亡率明顯降低,呈現(xiàn)凋亡抑制狀態(tài)。(2)對細胞惡性程度的變化分析發(fā)現(xiàn):香煙煙霧染毒至5代時細胞即已獲得惡性轉化,表現(xiàn)為抗血清生長能力增強,在含10％血清培養(yǎng)基中細胞克隆形成率可達32.34％(P

6、<0.05),同時獲得錨著獨立生長能力,其克隆形成率可達8.48％(P<0.05)。至染毒40代細胞時上述兩項指標分別達到97.11％、89.17％(均P<0.05),表明該細胞惡性程度已相當高。bcl-2基因mRNA在對照組及各染毒組細胞均未表達； p16基因mRNA在對照組細胞中高表達,各染煙組細胞表達量圍繞對照組表達量上下波動,總體呈現(xiàn)穩(wěn)定表達趨勢； Survivin基因mRNA在對照組細胞中無表達,隨著染毒代數(shù)的增加均高表達,呈

7、現(xiàn)劑量效應關系。(3)對RASSF1A、MGMT、p16、DAPK-1、APC基因啟動子特異位點的甲基化狀況進行檢測后發(fā)現(xiàn):對照組細胞RASSF1A、MGMT基因無甲基化表達,自染煙5代細胞開始即已開始甲基化表達,至染煙40代細胞一直穩(wěn)定表達；對照組細胞及各染毒代細胞p16、APC基因均無甲基化表達；DAPK-1基因在對照組細胞及各染毒代細胞均為甲基化表達。對RASSF1A基因mRNA表達水平分析后發(fā)現(xiàn):該基因在對照組細胞中高表達,各染

8、煙組細胞mRNA表達水平均顯著降低,并呈現(xiàn)劑量依賴性關系(P<0.01)。MGMT基因在對照組細胞高表達,染煙后表達水平均顯著降低,同樣呈現(xiàn)劑量效應關系(P<0.01)。
　　 結論:1.建立了香煙煙霧誘導BEAS-2B細胞體外惡性轉化的細胞模型,獲得了體外染毒的最佳濃度和最佳染毒時間。2.細胞惡性轉化過程中相關基因表達發(fā)生了改變。3.RASSF1A、MGMT基因啟動子區(qū)甲基化和表達水平降低可能在香煙煙霧誘導BEAS-2B細胞惡