早期胚胎細胞中HBs和HBx基因的表達與其啟動子甲基化狀態(tài)的關系.pdf

1、【背景與目的】：
　　乙型肝炎是世界各國尤其是我國當前面臨的重大公共衛(wèi)生問題,因此其傳播途徑,發(fā)病機制及診療手段的研究一直是各國政府和科學家關注的課題。已有研究證實,乙肝病毒(HBV)基因能夠整合到人精子染色體中,由精子帶入受精卵的HBV基因能夠在早期胚胎細胞中復制與表達,但其分子機制尚不清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的一個重要內(nèi)容,在早期胚胎發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。它也是細胞調(diào)控宿主基因表達和進入細胞內(nèi)的病毒基因表達的重要方

2、式。HBV感染可導致宿主細胞表觀遺傳修飾異常,誘發(fā)染色體不穩(wěn)定,進而影響胚胎的正常發(fā)育,整合在宿主基因組中的HBV基因?qū)⒃黾釉l(fā)性肝癌發(fā)生的風險。本課題的目的是通過研究HBV基因在精子、早期胚胎細胞中的甲基化狀況,探討它與HBV基因在早期胚胎細胞中表達的關系。
　　【材料與方法】：
　　(1)材料:①重組質(zhì)粒pBR322-HBV;②6-8周齡雌性金黃地鼠;③人精子由HBsAg陰性的志愿者提供;④甲基化試劑盒(Chemicom

3、公司,S7820);(2)方法:①重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術:用pBR322-HBV轉(zhuǎn)染人精子。②用PCR,斑點雜交技術:證實轉(zhuǎn)染的人精子中含有HBV DNA。③人精子、金黃地鼠去透明帶卵母細胞異種體外受精及受精后培養(yǎng)技術:獲得早期胚胎細胞。④甲基化PCR(MSP)檢測技術:檢測HBs和HBx基因啟動子在精子和早期胚胎細胞中的甲基化狀況。⑤甲基化測序 PCR及 BLAST分析技術:精確檢測HBs基因啟動子的甲基化狀態(tài)。⑥RT-PCR技術:檢測胚胎

4、細胞中HBs和HBx基因的表達。
　　【結(jié)果】：
　　①斑點雜交結(jié)果顯示,用pBR332-HBV轉(zhuǎn)染的人精子經(jīng)6次洗滌后,洗液中已不再有HBV DNA,排除了由于洗液污染給實驗結(jié)果帶來的假陽性的可能。②PCR結(jié)果表明,精子和早期胚胎細胞基因組中含有 HBV DNA序列。③通過人精子、地鼠去透明帶卵母細胞異種體外受精及受精后培養(yǎng),獲得了實驗所需的單細胞胚和2-細胞胚樣本。④甲基化特異性PCR(MSP)檢測結(jié)果表明,在重組質(zhì)粒p

5、BR332-HBV中,HBs和HBx基因啟動子區(qū)是非甲基化的;而在精子基因組中HBs和HBx基因啟動子區(qū)已經(jīng)甲基化了;在單細胞胚和2-細胞胚基因組中,HBs和HBx基因啟動子區(qū)呈去甲基化狀態(tài)。⑤甲基化測序 PCR(BSP)及 BLAST分析表明,在精子基因組樣本中可擴增出 HBs基因啟動子區(qū)112 bp的陽性條帶,條帶區(qū)域的所有 CpG位點呈甲基化狀態(tài)。⑥RT-PCR結(jié)果表明,由精子帶入受精卵的HBs和HBx基因能夠在早期胚胎細胞中表達