香煙提取物對大鼠骨骼肌細胞MSTN及MHC表達的影響.pdf

1、目的：
　　本研究從細胞模型水平，采用分子生物學和生理學的方法，研究MSTN參與COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制，以及骨骼肌纖維的轉換，為進一步闡明COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制并對其進行治療提供提供新的思路及策略。再者，證實香煙對骨骼肌的毒性作用，戒煙是防治COPD/肺氣腫的重要有效措施，具有重要的臨床和社會價值。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)股四頭肌細胞:選鼠齡3～5 d的SD大鼠拉頸處死，取大腿股四頭肌肌肉，去脂肪

2、、血液、結締組織，剪碎1mm3;在體外行骨骼肌原代細胞培養(yǎng)（分別行組織塊培養(yǎng)、單層細胞培養(yǎng)），倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征;細胞鑒定:取第3-5代細胞分化成熟后，行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察細胞形態(tài)特征，以及細胞免疫熒光鑒定;明確貼壁細胞為骨骼肌細胞。
　　1)實驗分組:取第10代以內細胞，當細胞覆蓋50％培養(yǎng)瓶時，分別加入含有0％、2.5％、5％、10％ CSE的胎牛血清培養(yǎng)基（香煙提取物統(tǒng)一為使用前30分鐘制備），放置培養(yǎng)

3、箱48小時后;隨機分四組:正常對照組、2.5％ CSE組、5.0％CSE組、10.0％CSE組。
　　2)基因水平檢測:分別提取四組細胞的RNA，逆轉錄合成cDNA，實時定量PCR檢測MSTN mRNA、MHC-Ⅰ mRNA、MHC-Ⅱ A mRNA、MHC-ⅡB mRNA的表達。
　　3)蛋白水平檢測:分別提取四組細胞的蛋白，煮沸變性，電泳、電轉，Westernblotting檢測MSTN蛋白的表達。
　　4)統(tǒng)計學

4、方法:計量資料以（(X)±s）表示，多組間比較采用單因素one-wayANOVA方差分析檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　(1)體外成功原代培養(yǎng)SD大鼠骨骼肌細胞:SD大鼠骨骼肌細胞在倒置顯微鏡下觀察可見，骨骼肌細胞剛鋪板于胎牛血清培養(yǎng)基時細胞呈圓形，形態(tài)均一，折光性強，懸浮于培養(yǎng)基中;5～6h后開始貼壁，24 h后完全貼壁，并開始增生，細胞逐漸延伸成梭形，相互融合，按一定方向有序排列。隨細胞密度的增

5、加，細胞逐漸有規(guī)律地平行排列;培養(yǎng)至2～3 d時細胞分化達到高峰，隨后逐漸開始凋亡、漂浮。HE染色可見細胞核呈扁橢圓形，染成藍色，符合骨骼肌細胞的形態(tài)學特點;細胞免疫熒光檢查提示90％以上的細胞呈陽性反應，細胞核染成藍色，符合骨骼肌細胞的表型特征。
　　(2)MSTN mRNA實時定量PCR檢測結果顯示:4組MSTN mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);其中，5.0％組、10.0％組MSTN mRNA相對表達

6、量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);伴隨CSE的濃度升高，目標基因表達越高。支持當初的實驗設想，MSTN隨CSE的濃度升高，表達越高，(P＜0.05）。
　　(3)MHC-Ⅰ mRNA實時定量PCR檢測結果顯示:4組MHC-ⅠmRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);其中，5.0％組、10.0％組MHC-ⅠmRNA相對表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);伴隨CSE的濃度升高，目標基因表達

7、越低。支持當初的實驗設想，MHC-Ⅰ隨CSE的濃度升高，表達越低，（P＜0.05）。
　　(4)MHC-ⅡA mRNA實時定量PCR檢測結果顯示:4組MHC-ⅡA mRNA相對表達量比較，其中，2.5％組、5.0％組、10.0％組MHC-ⅡA mRNA相對表達量低于對照組，只有2.5％組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而5.0％組、10.0％組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(5)MHC-Ⅱ BmRNA實時定量PC

8、R檢測結果顯示:經(jīng)3次更換MHC-ⅡB的引物，反復實驗，均未能作出擴增曲線及溶解曲線。
　　(6)MSTN蛋白Western blotting檢測結果顯示:4組MSTN蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);其中，5.0％組、10.0％組MSTN蛋白表達水平高于對照組和2.5％組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;伴隨CSE的濃度升高，目標蛋白表達越高。支持當初的實驗設想，MSTN隨CSE的濃度升高，表達越高，(P＜0