亞低溫通過Nrf2-Keap1-ARE通路減輕海馬神經(jīng)元細胞損傷的研究.pdf

1、氧化應(yīng)激是心肺復(fù)蘇（CPR）后腦損害的主要病理機制之一。目前，亞低溫（mildhypothermia，MHT）治療是唯一被臨床證實能提高患者生存率、改善神經(jīng)功能預(yù)后的治療方式，但其具體機制尚不明確。研究MHT減輕CPR后腦損傷的機制，具有重要的科學(xué)意義和臨床實用價值。
　　研究目的：
　　本論文擬通過建立SD新生鼠原代海馬神經(jīng)元細胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen andglucose deprivation/reperfu

2、sion,OGD/R）模型，探究亞低溫（MHT）是否通過介導(dǎo)Nrf2/Keap1/ARE通路減輕海馬神經(jīng)元細胞OGD/R損傷及其保護機制。
　　研究方法：
　　1.探討Nrf2在原代海馬神經(jīng)元細胞OGD/R損傷中的作用
　　1)提取新生鼠（<1d）原代海馬神經(jīng)元細胞，于體外培養(yǎng)第7天，隨機分組后分別建立OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型；
　　2)最佳藥物濃度的篩選：分別采用MTT法、測定

3、細胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量來測定Nrf2激動劑萊菔硫烷（SFN）、抑制劑鴉膽苦醇（BST）在不同藥物濃度下細胞的存活率、損傷程度；
　　3)細胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測：采用相關(guān)檢測試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)上清中的SOD活力、GSH含量和MDA含量；
　　4)采用凋亡檢測試劑盒原位檢測各組細胞DNA凋亡片段化情況，計算各處理組細胞的凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。
　　2探討MHT在原代海馬神經(jīng)元

4、細胞OGD/R損傷中的作用
　　1)提取新生鼠（<1d）原代海馬神經(jīng)元細胞，于體外培養(yǎng)第7天，隨機分為三組：對照組（C）、亞低溫（MHT）組、MHT+BST組，分別建立 OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型；
　　2)細胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測：采用相關(guān)測定試劑盒分別檢測C組、MHT組、MHT+BST組細胞培養(yǎng)上清中的SOD活力、GSH含量和MDA含量；
　　3)采用凋亡檢測試劑盒原位檢測各

5、組細胞DNA凋亡片段化情況，并計算各處理組細胞的凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。
　　3探討MHT減輕原代海馬神經(jīng)元細胞OGD/R損傷的分子機制
　　1)提取新生鼠（<1d）原代海馬神經(jīng)元細胞，于培養(yǎng)第7天,隨機分為C組、SFN組、BST組、MHT組、MHT+BST組后分別建立OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型；
　　2)Western blot分別檢測各組細胞在OGD3hR0

6、h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型中HO-1、Nrf2的蛋白表達變化；
　　3)RT-qPCR分別檢測各組細胞在OGD3hR0h、OGD3hR6h、OGD3hR12h模型中HO-1、Nrf2的RNA表達水平的變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.探討Nrf2在原代海馬神經(jīng)元細胞OGD/R損傷中的作用
　　1)綜合MTT及細胞LDH釋放量的檢測結(jié)果篩選并驗證出SFN20μmol/l、BST40nmol/l為最佳

7、藥物濃度；
　　2)細胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測結(jié)果表明：與C組相比，SFN組明顯減輕細胞的氧化損傷，BST組加重了細胞的氧化損傷；
　　3)TUNEL染色結(jié)果顯示：SFN組較C組細胞狀態(tài)明顯良好，細胞凋亡指數(shù)降低；BST組較C組細胞狀態(tài)明顯更差，細胞凋亡指數(shù)升高。
　　2.探討MHT在原代海馬神經(jīng)元細胞OGD/R損傷中的作用
　　1)細胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶及代謝物的檢測結(jié)果表明：與C組相比，MHT組明顯減輕細胞

8、的氧化損傷，MHT+BST組中BST拮抗了MHT的保護作用同時加重了細胞的氧化損傷；
　　2) TUNEL染色結(jié)果顯示：Hypo組較 C組凋亡細胞減少，凋亡指數(shù)降低；Hypo+BST組較C組凋亡細胞增多，凋亡指數(shù)升高。
　　3.探討MHT減輕原代海馬神經(jīng)元細胞OGD/R損傷的分子機制
　　1)Western blot結(jié)果表明：SFN組、Hypo組較C組各相應(yīng)時間段Nrf2蛋白表達增加；BST組和MHT+BST組隨R時間

9、增加Nrf2蛋白表達減少至完全阻斷表達；HO-1蛋白作為受Nrf2調(diào)控的下游蛋白，其表達趨勢與Nrf2相似。
　　2)RT-qPCR結(jié)果表明：SFN組、Hypo組較C組各相應(yīng)時間段Nrf2 mRNA、HO-1mRNA表達增加；BST組和MHT+BST組隨R時間增加Nrf2 mRNA、HO-1mRNA表達明顯減少。
　　結(jié)論：
　　亞低溫可以減輕OGD/R引起的海馬神經(jīng)元損傷，這可能與激活Nrf2/Keap1/ARE通路