Nrf2-ARE通路在低劑量LPS處理PC12細胞中的表達及其對脊髓損傷神經(jīng)元的保護作用研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)是危害人類健康的嚴重疾病，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，發(fā)病率增長明顯。SCI功能缺失主要是由于脊髓神經(jīng)元軸突和神經(jīng)元的靶聯(lián)系信息中斷及SCI誘發(fā)神經(jīng)元病理性死亡及凋亡引起的。保護神經(jīng)元、促進軸突再生是改善SCI病人預后功能的關鍵。SCI中的繼發(fā)性損傷由于具有可逆性和可調控性成為研究的重點，然而繼發(fā)性損傷的機制繁多，作用復雜，研究起來十分困難，其中氧化應激由于作用明確，且與很多機制相聯(lián)系，成為目前研究的一個熱點。
　　

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷存在炎癥反應，并且SCI中的炎癥反應比創(chuàng)傷性腦損傷的炎癥反應更明顯。炎癥反應一方面可以加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，另一方面又促進損傷的修復。核因子E2 p45相關因子2(Nrf2)是一種新發(fā)現(xiàn)的轉錄因子，在多種刺激作下，Nrf2可以和細胞核內的抗氧化反應元件(ARE)結合，啟動抗氧化元件調控的一系列保護性分子的表達。近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/ARE通路在調控炎癥免疫反應中發(fā)揮重要作用，可能是天然免疫反應和機體存活的關鍵調控

3、因子。結合臨床實際，我們提出：SCI的炎癥反應可能激活Nrf2/ARE抗氧化機制，適量的炎癥反應可能有助于保護神經(jīng)元細胞，改善SCI的預后功能，而其中Nrf2/ARE抗氧化機制可能發(fā)揮重要作用。
　　 本研究擬以低劑量LPS刺激PC12細胞，建立體外神經(jīng)元細胞炎癥刺激模型，探討低劑量LPS對PC12細胞Nrf2/ARE通路的影響，以及對PC12細胞再灌注損傷的保護的作用；構建Nrf2重組腺病毒載體，一方面通過體外實驗研究Nrf2

4、過表達對PC12細胞增殖影響以及保護作用，另一方面構建大鼠SCI模型，通過體內實驗研究Nrf2重組腺病毒轉染對神經(jīng)元Nrf2/ARE抗氧化機制，以及對神經(jīng)細胞凋亡，大鼠預后功能的影響。研究內容包括以下三部分：
　　 第一部分、低劑量LPS對PC12細胞中Nrf2/ARE抗氧化機制的影響及其在再灌注損傷的保護作用研究
　　 目的：探討低劑量LPS對PC12細胞內Nrf2及其下游調控因子HO-1、NQO1、γ-GCS的影響，

5、并研究Nrf2/ARE抗氧化機制在低劑量LPS預處理PC12細胞再灌注損傷保護中的作用。
　　 方法：用MTT法確立LPS的安全劑量。采用熒光定量PCR、Western-blot、免疫熒光檢測低劑量LPS對PC12細胞內Nrf2 mRNA、總Nrf2蛋白表達及其在細胞質、細胞核分布的影響，并用Western-blot檢測HO-1、NQO1、γ-GCS的表達。建立PC12細胞再灌注損傷模型，采用Hoechst33258染色檢測低劑

6、量LPS缺血缺氧期預處理再灌注24h的細胞凋亡情況；流式細胞儀檢測缺血缺氧末及再灌注6h細胞的ROS；酶法檢測LDH釋放率；Western-blot檢測缺血缺氧末細胞核Nrf2及細胞HO-1、NQO1、γ-GCS的表達。
　　 結果：不大于0.1μg/μl的LPS對PC12細胞是安全的(P>0.05)。用0.1μg/μl LPS處理PC12細胞，Nrf2 mRNA、總Nrf2蛋白表達6h開始升高(P<0.05)，24h達峰值(P

7、<0.01)；細胞質Nrf2蛋白表達1h開始降低(P<0.01)，同時細胞核Nrf2蛋白開始升高(P<0.05)；免疫熒光顯示細胞核內的Nrf2蛋白3h比1h表達明顯；細胞內HO-1、NQO1、γ-GCS表達相應升高，峰值均在24h。在PC12細胞再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，再灌注24h，低劑量LPS預處理組細胞凋亡數(shù)明顯減少，以0.05μg/μl LPS組最為明顯(與未加LPS組比較P<0.05)，LDH的釋放率相應降低。缺血缺氧末測得的細

8、胞內ROS表達隨LPS劑量增加而增加，再灌注6h，ROS出現(xiàn)隨LPS劑量增加先降低后升高趨勢，其中0.025μg/μl LPS組降低最為明顯(與未加LPS組比較P<0.05)；缺血缺氧末細胞核Nrf2及細胞HO-1、NQO1、γ-GCS表達均增高，其中以0.05μg/μl LPS組最為明顯。
　　 結論：低劑量的LPS能夠促進PC12細胞內Nrf2的轉錄、翻譯，以及從細胞質到細胞核的轉移，激活Nrf2/ARE抗氧化機制；低劑量L

9、PS預處理PC12細胞有助于細胞抵抗再灌注損傷，而其中Nrf2/ARE抗氧化機制可能發(fā)揮了重要作用。
　　 第二部分、Nrf2重組腺病毒構建及其對PC12細胞的影響
　　 目的：構建Nrf2重組腺病毒載體，并觀察檢測其對PC12細胞的影響。
　　 方法：將腺病毒穿梭質粒pAV-MCMV-GFP-Nrf2與腺病毒輔助包裝質粒pBHG lox△E1，3 Cre共轉染HEK293細胞，得到Nrf2重組腺病毒，RT-PC

10、R鑒定目的基因的表達，并進行擴增、純化及滴度鑒定。用重組腺病毒轉染PC12細胞，Western-blot檢測PC12細胞中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS的表達；顯微鏡下觀察Nrf2重組腺病毒對PC12細胞增殖的影響及對LPS的抵抗能力；流式細胞儀檢測Nrf2過表達對PC12細胞生長周期的影響；Western-blot檢測LPS刺激下IL-1β、Caspase-3的表達變化。
　　 結果：Nrf2重組腺病毒構建成功，PC

11、R結果顯示與穿梭質粒pAV-MCMV-GFP-Nrf2目的基因一致，擴增純化可以得到7.9×1010pfu/ml病毒懸液。將Nrf2重組腺病毒轉染PC12細胞，發(fā)現(xiàn)其能促進PC12細胞中Nrf2(細胞質/細胞核)、HO-1、NQO1、γ-GCS的表達，并抑制PC12細胞增殖，抵抗LPS的毒性損傷作用，降低IL-1β、Caspase-3的表達。
　　 結論：成功構建Nrf2重組腺病毒；Nrf2重組腺病毒轉染能促進PC12細胞Nrf

12、2/ARE抗氧化因子的表達，抑制細胞增殖，增強PC12細胞抗凋亡/壞死及抗炎能力。
　　 第三部分、Nrf2對脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)元的保護作用
　　 目的：觀察檢測Nrf2過表達對脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)元的保護作用。
　　 方法：將160只SD大鼠隨機分為4組：A組(假手術組)，B組(SCI組)，C組(Ad-Nrf2組)，D組(Ad-GFP組)，建立動物模型。觀察術后大鼠的運動功能，并行BBB評分；大體觀察脊髓標本

13、，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察腺病毒的轉染情況；組織切片HE染色，觀察大鼠脊髓組織的形態(tài)學變化，水腫、炎癥反應情況；免疫組化法檢測組織切片中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表達；TUNEL法檢測組織切片中神經(jīng)細胞的凋亡；免疫組化法檢測組織切片中GAP-43的表達。
　　 結果：C組大鼠術后2w開始運動功能有明顯改善(與B、D組比較P<0.05)。大體觀察發(fā)現(xiàn)，術后4w C組脊髓保留相對較好。冰凍切片熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)術后1

14、d C組既有較強的綠色熒光表達，主要分布在注射階段，術后3d，綠色熒光表達最強，損傷區(qū)熒光明顯，之后綠色熒光表達逐漸減弱，術后4w仍可見少量綠色熒光表達。HE顯示術后2w、4w C組脊髓炎性反應較輕，神經(jīng)元保留較多。免疫組化發(fā)現(xiàn)C組損傷脊髓中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表達陽性細胞數(shù)增多，著色較深，術后3d達峰值(與B、D組比較P<0.01)；GAP-43表達陽性細胞增多，7d達峰值(與B、D組比較P<0.01)。TUNEL