納米氧化鋅顆粒誘導BEAS-2B細胞IL-8基因表達的機制.pdf

1、[研究背景]納米顆粒是尺寸小于100 nm的人造顆粒物,具有廣泛的用途。納米金屬氧化物(如納米氧化鋅)是目前世界上納米產(chǎn)量噸位較高的納米材料。納米氧化鋅顆粒(Zinc Oxide nanoparicles,ZnO-NPS)可通過呼吸道、皮膚、消化道等途徑進入人體。志愿者吸入實驗研究結(jié)果表明,ZnO-NPs可引起“金屬煙霧熱”；支氣管灌洗液中炎癥細胞介素水平如白細胞介素8(Interleukin8,IL-8)以及中性粒細胞數(shù)目均較對照組明

2、顯升高。體外研究結(jié)果顯示,ZnO-NPs可刺激人呼吸道上皮細胞產(chǎn)生過量的IL-8。呼吸道IL-8主要來源于上皮細胞,在介導外源性毒物所致各種肺臟疾病過程中起關鍵作用。目前,ZnO-NPs所致IL-8基因表達的機制尚不清楚。
　　 [研究目的]闡明國產(chǎn)ZnO-NPs(30 nm)對人支氣管上皮細胞IL-8基因表達的影響；揭示納米氧化鋅顆粒誘導IL-8基因表達的分子生物學機制。
　　 [研究方法]以人支氣管上皮細胞株(BEA

3、S-2B)為體外模型。用MTT方法測定ZnO-NPs對細胞的損傷作用。用RT-PCR和ELISA方法分別測定ZnO-NPs對IL-8mRNA和蛋白表達水平的影響。使用轉(zhuǎn)錄抑制劑和表達突變IL-8基因促進子的BEAS-2B細胞株觀察ZnO-NPs對IL-8基因轉(zhuǎn)錄的影響。利用IL-8 mRNA降解試驗測定ZnO-NPs對轉(zhuǎn)錄后IL-8 mRNA穩(wěn)定性的影響。利用胞噬作用抑制劑觀察細胞吞噬作用在ZnO-NPs所致IL-8表達過程中的作用。此

4、外,利用原子吸收光譜手段測定ZnO-NPs在培養(yǎng)液中的溶解水平。
　　 [研究結(jié)果]ZnO-NPs刺激可致細胞內(nèi)IL-8 mRNA水平及培養(yǎng)液上清中IL-8蛋白含量明顯升高,該作用呈時間(2 h～4 h)及劑量(1μg/cm2～4μg/cm2)依賴性(P=0.000)。用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(1μg/ml)預處理細胞30 min,可顯著降低ZnO-NPs(4μg/cm2,2 h)對IL-8 mRNA表達的誘導作用(P=0.000

5、),表明ZnO-NPs在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-8基因表達。利用可表達野生型、NFκB和C/EBPβ結(jié)合位點突變型IL-8促進子的BEAS-2B細胞株,觀察到在表達突變IL-8促進子細胞內(nèi),ZnO-NPs(4μg/cm2,2 h)對IL-8轉(zhuǎn)錄活性的影響較在野生型細胞明顯降低(P=0.000),說明轉(zhuǎn)錄因子NFκB和C/EBPβ參與調(diào)節(jié)納米氧化鋅對IL-8基因轉(zhuǎn)錄的誘導過程。在用放線菌素D終止IL-8 mRNA合成的前提下,ZnO-NPs(4

6、μg/cm2)可明顯減緩細胞內(nèi)IL-8 mRNA的降解,表現(xiàn)為在不同作用時間點(1h,2h,4h),ZnO-NPs處理組IL-8 mRNA水平均較相應對照組(無ZnO-NPs刺激)高(p值分別為0.021、0.002、0.001),說明ZnO-NPs對IL-8 mRNA有穩(wěn)定作用。用細胞松弛素B(10μg/ml)預處理細胞30 min,可明顯降低ZnO-NPs(4μg/cm2,2 h)對IL-8 mRNA表達的誘導作用(抑制率為30.1

7、4％)(P=0.000),提示部分ZnO-NPs可通過胞噬作用進入細胞進而誘導IL-8的表達。8μg/ml(相當于24孔培養(yǎng)板-孔內(nèi)加入4μg/cm2 ZnO-NPs)ZnO-NPs在培養(yǎng)液中37℃溫育2 h,有4.3％的ZnO-NPs溶解,培養(yǎng)液上清中鋅離子的濃度為3.57μM。
　　 [結(jié)論]ZnO-NPs刺激可明顯提高人支氣管上皮細胞內(nèi)IL-8 mRNA和蛋白的表達水平;轉(zhuǎn)錄因子NFκB和C/EBPβ在ZnO-NPs所致I