腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的腦紅蛋白基因?qū)Υ笫蠹顾钃p傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1．原代脊髓神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)及鑒定；
　　2．構(gòu)建Ngb重組腺相關(guān)病毒（AAV-Ngb）并利用其轉(zhuǎn)染大鼠脊髓神經(jīng)元和脊髓組織細(xì)胞；
　　3．研究AAV-Ngb對脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用；
　　4．研究AAV-Ngb對大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用；
　　5．探討AAV-Ngb對大鼠脊髓損傷后JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響。
　　方法：
　　1．采用Accutase酶消化聯(lián)合機(jī)械

2、法分離胚胎脊髓神經(jīng)元，應(yīng)用Nissl染色和免疫熒光染色法鑒定脊髓神經(jīng)元；
　　2．構(gòu)建攜帶Ngb基因的重組腺相關(guān)病毒載體，Real-time PCR檢測腺相關(guān)病毒滴度；以Ngb重組腺相關(guān)病毒感染原代脊髓神經(jīng)元，通過熒光表達(dá)法判定感染復(fù)數(shù)（Multiplicities of infection, MOI）；以Ngb重組腺相關(guān)病毒注射局部脊髓組織，通過熒光顯微鏡觀察EGFP熒光表達(dá)情況，應(yīng)用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后脊髓組織中

3、Ngb的表達(dá)情況；
　　3．采用H2O2建立原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型；按不同處理因素分為對照組、單純損傷組、AAV-EGFP組和AAV-Ngb組；應(yīng)用CCK-8試劑觀察AAV-Ngb對神經(jīng)元活性的影響；丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和SOD試劑檢測AAV-Ngb對神經(jīng)元MDA、SOD的影響；超氧化物陰離子熒光探針（DHE）檢測活性氧水平；Hoechst33342染色法和流式細(xì)胞術(shù)觀察神經(jīng)元凋亡水平；T

4、MRM試劑檢測線粒體膜電位；以及Western blot檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cytochrome c和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。
　　4．采用重物壓迫建立大鼠脊髓損傷模型；通過BBB評(píng)分觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能；TUNEL熒光染色法檢測脊髓組織細(xì)胞凋亡情況；neuN免疫熒光染色法檢測脊髓組織中神經(jīng)元存活情況；MDA及SOD試劑盒檢測脊髓組織中MDA和SOD含量；Western Blot

5、和免疫熒光染色法檢測脊髓組織線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cytochrome c和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況；
　　5．在大鼠SCI前、SCI后1h、3h、6h、12h、1 d、3d、7d八個(gè)時(shí)間分別取材，通過Western blot檢測SCI后JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表達(dá)水平；分別給予NS、AAV-EGFP、AAV-Ngb、AAV

6、-Ngb+AG490預(yù)處理，取上述p-JAK2、p-STAT3表達(dá)峰值時(shí)間點(diǎn)作為觀察時(shí)間點(diǎn)，Western blot法檢測損傷脊髓組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1．通過Accutase酶消化聯(lián)合機(jī)械法獲得的神經(jīng)元產(chǎn)量高、細(xì)胞活性好；細(xì)胞尼氏染色可見大量的特異性尼氏體，并表達(dá)特異性蛋白βtubulin-Ⅲ，符合脊髓神經(jīng)元的特征；
　　2．成功構(gòu)建Ngb重組腺相關(guān)病毒

7、并測定其滴度；將AAV-Ngb成功轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中，確定了AAV-Ngb的最佳MOI值為105；將Ngb基因成功轉(zhuǎn)染至大鼠脊髓組織細(xì)胞中，并證明轉(zhuǎn)染AAV-Ngb的脊髓組織能持續(xù)高水平表達(dá)Ngb蛋白；
　　3．成功建立原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型；與對照組相比，單純損傷組、AAV-EGFP組和AAV-Ngb組神經(jīng)元細(xì)胞活性、SOD含量、線粒體膜電位、Bcl-2和線粒體內(nèi)cytocheome C顯著下降，細(xì)胞MDA含

8、量、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、凋亡細(xì)胞、Bax、胞漿中cytochrome C和活化的caspase-3明顯增加；與單純損傷組相比，AAV-Ngb組神經(jīng)元細(xì)胞活性、SOD含量、線粒體膜電位、Bcl-2和線粒體內(nèi)cytochrome C明顯提高，細(xì)胞MDA含量、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、凋亡細(xì)胞、Bax、胞漿中cytochrome C和活化的caspase-3顯著降低；
　　4．成功建立大鼠重物壓迫損傷模型；與對照組相比，單純損傷組、AAV-EGF

9、P組和AAV-Ngb組的運(yùn)動(dòng)功能以及脊髓組織SOD含量、Bcl-2和線粒體內(nèi)cytochrome C顯著下降，脊髓組織MDA含量、凋亡細(xì)胞、Bax、胞漿中cytochrome C和活化的caspase-3明顯增加；與單純損傷組相比， AAV-EGFP組的各個(gè)指標(biāo)沒有明顯差異，AAV-Ngb組的運(yùn)動(dòng)功能以及脊髓組織SOD含量、Bcl-2和線粒體內(nèi)cytochrome C明顯增加，脊髓組織MDA含量、凋亡細(xì)胞、Bax、胞漿中cytochro

10、me C和活化的caspase-3顯著減少；
　　5．p-JAK2和p-STAT3表達(dá)高峰時(shí)間點(diǎn)為SCI后12h；與對照組相比，單純損傷組、AAV-EGFP組、AAV-Ngb組和AAV-Ngb+AG490組動(dòng)物的p-JAK2和p-STAT3表達(dá)顯著增加；與單純損傷組相比，AAV-Ngb組和AAV-Ngb+AG490組動(dòng)物的p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯增加；與AAV-Ngb組相比，AAV-Ngb+AG490組動(dòng)物的p-JAK

11、2和p-STAT3表達(dá)顯著減少。
　　結(jié)論：
　　1．Accutase酶消化聯(lián)合機(jī)械法分離的脊髓神經(jīng)元產(chǎn)量高、細(xì)胞活性好和純度較高；
　　2．成功構(gòu)建Ngb重組腺相關(guān)病毒，并將Ngb基因成功轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元或者脊髓組織中，實(shí)現(xiàn)Ngb的穩(wěn)定高水平表達(dá)；
　　3．過表達(dá)Ngb能改善原代脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷后神經(jīng)元細(xì)胞活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡途徑從而抑制細(xì)胞凋亡