腺相關病毒介導的腦紅蛋白基因對大鼠脊髓損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　1．原代脊髓神經元的分離、培養(yǎng)及鑒定；
　　2．構建Ngb重組腺相關病毒（AAV-Ngb）并利用其轉染大鼠脊髓神經元和脊髓組織細胞；
　　3．研究AAV-Ngb對脊髓神經元氧化應激損傷的保護作用；
　　4．研究AAV-Ngb對大鼠脊髓損傷的保護作用；
　　5．探討AAV-Ngb對大鼠脊髓損傷后JAK2/STAT3信號通路的影響。
　　方法：
　　1．采用Accutase酶消化聯合機械

2、法分離胚胎脊髓神經元，應用Nissl染色和免疫熒光染色法鑒定脊髓神經元；
　　2．構建攜帶Ngb基因的重組腺相關病毒載體，Real-time PCR檢測腺相關病毒滴度；以Ngb重組腺相關病毒感染原代脊髓神經元，通過熒光表達法判定感染復數（Multiplicities of infection, MOI）；以Ngb重組腺相關病毒注射局部脊髓組織，通過熒光顯微鏡觀察EGFP熒光表達情況，應用Western blot檢測轉染后脊髓組織中

3、Ngb的表達情況；
　　3．采用H2O2建立原代培養(yǎng)脊髓神經元氧化應激損傷模型；按不同處理因素分為對照組、單純損傷組、AAV-EGFP組和AAV-Ngb組；應用CCK-8試劑觀察AAV-Ngb對神經元活性的影響；丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和SOD試劑檢測AAV-Ngb對神經元MDA、SOD的影響；超氧化物陰離子熒光探針（DHE）檢測活性氧水平；Hoechst33342染色法和流式細胞術觀察神經元凋亡水平；T

4、MRM試劑檢測線粒體膜電位；以及Western blot檢測線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、Bcl-2、cytochrome c和cleaved caspase-3蛋白的表達水平。
　　4．采用重物壓迫建立大鼠脊髓損傷模型；通過BBB評分觀察大鼠后肢運動功能；TUNEL熒光染色法檢測脊髓組織細胞凋亡情況；neuN免疫熒光染色法檢測脊髓組織中神經元存活情況；MDA及SOD試劑盒檢測脊髓組織中MDA和SOD含量；Western Blot

5、和免疫熒光染色法檢測脊髓組織線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、Bcl-2、cytochrome c和cleaved caspase-3蛋白的表達情況；
　　5．在大鼠SCI前、SCI后1h、3h、6h、12h、1 d、3d、7d八個時間分別取材，通過Western blot檢測SCI后JAK2/STAT3信號通路相關蛋白JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表達水平；分別給予NS、AAV-EGFP、AAV-Ngb、AAV

6、-Ngb+AG490預處理，取上述p-JAK2、p-STAT3表達峰值時間點作為觀察時間點，Western blot法檢測損傷脊髓組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表達水平。
　　結果：
　　1．通過Accutase酶消化聯合機械法獲得的神經元產量高、細胞活性好；細胞尼氏染色可見大量的特異性尼氏體，并表達特異性蛋白βtubulin-Ⅲ，符合脊髓神經元的特征；
　　2．成功構建Ngb重組腺相關病毒

7、并測定其滴度；將AAV-Ngb成功轉染至原代培養(yǎng)脊髓神經元中，確定了AAV-Ngb的最佳MOI值為105；將Ngb基因成功轉染至大鼠脊髓組織細胞中，并證明轉染AAV-Ngb的脊髓組織能持續(xù)高水平表達Ngb蛋白；
　　3．成功建立原代培養(yǎng)脊髓神經元氧化應激損傷模型；與對照組相比，單純損傷組、AAV-EGFP組和AAV-Ngb組神經元細胞活性、SOD含量、線粒體膜電位、Bcl-2和線粒體內cytocheome C顯著下降，細胞MDA含

8、量、細胞內活性氧水平、凋亡細胞、Bax、胞漿中cytochrome C和活化的caspase-3明顯增加；與單純損傷組相比，AAV-Ngb組神經元細胞活性、SOD含量、線粒體膜電位、Bcl-2和線粒體內cytochrome C明顯提高，細胞MDA含量、細胞內活性氧水平、凋亡細胞、Bax、胞漿中cytochrome C和活化的caspase-3顯著降低；
　　4．成功建立大鼠重物壓迫損傷模型；與對照組相比，單純損傷組、AAV-EGF

9、P組和AAV-Ngb組的運動功能以及脊髓組織SOD含量、Bcl-2和線粒體內cytochrome C顯著下降，脊髓組織MDA含量、凋亡細胞、Bax、胞漿中cytochrome C和活化的caspase-3明顯增加；與單純損傷組相比， AAV-EGFP組的各個指標沒有明顯差異，AAV-Ngb組的運動功能以及脊髓組織SOD含量、Bcl-2和線粒體內cytochrome C明顯增加，脊髓組織MDA含量、凋亡細胞、Bax、胞漿中cytochro

10、me C和活化的caspase-3顯著減少；
　　5．p-JAK2和p-STAT3表達高峰時間點為SCI后12h；與對照組相比，單純損傷組、AAV-EGFP組、AAV-Ngb組和AAV-Ngb+AG490組動物的p-JAK2和p-STAT3表達顯著增加；與單純損傷組相比，AAV-Ngb組和AAV-Ngb+AG490組動物的p-JAK2和p-STAT3表達明顯增加；與AAV-Ngb組相比，AAV-Ngb+AG490組動物的p-JAK

11、2和p-STAT3表達顯著減少。
　　結論：
　　1．Accutase酶消化聯合機械法分離的脊髓神經元產量高、細胞活性好和純度較高；
　　2．成功構建Ngb重組腺相關病毒，并將Ngb基因成功轉染原代培養(yǎng)脊髓神經元或者脊髓組織中，實現Ngb的穩(wěn)定高水平表達；
　　3．過表達Ngb能改善原代脊髓神經元氧化應激損傷后神經元細胞活性，抑制氧化應激反應，減少細胞內活性氧，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡途徑從而抑制細胞凋亡