慢病毒介導(dǎo)CDNF轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是世界范圍的難治性疾病，可引起軸突損傷和神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下截癱及括約肌功能障礙，嚴(yán)重?fù)p害患者的生存質(zhì)量，加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于損傷局部不利環(huán)境的影響，如局部神經(jīng)炎癥、缺血、脂質(zhì)體過氧化、膠質(zhì)瘢痕形成等，脊髓神經(jīng)的修復(fù)再生極其有限。目前為止對于脊髓損傷的治療還沒有一種十分安全有效的的方法。當(dāng)前，細(xì)胞治療方興未艾，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marr

2、ow-derived mesenchymal stemcells，BMSCs)是細(xì)胞移植療法的重要一員，但BMSCs在治療脊髓損傷時的作用受到神經(jīng)炎癥等局部不利微環(huán)境的極大限制。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(cerebral dopamine neurotrophic factor, CDNF)能夠保護(hù)6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的中腦神經(jīng)元損害，并且能夠顯著促進(jìn)中腦神經(jīng)元功能的恢復(fù);在大鼠坐骨神經(jīng)離斷損傷模型中的研

3、究發(fā)現(xiàn)CDNF局部過表達(dá)能夠促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生和下肢功能的恢復(fù)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，是引起神經(jīng)炎癥與損傷的主要介導(dǎo)細(xì)胞，我們前期研究提示CDNF能夠減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥損傷。盡管CDNF的作用機(jī)制，包括其受體和涉及的信號通路尚不清楚，但它所展現(xiàn)的抗炎作用和神經(jīng)保護(hù)作用為脊髓損傷后的的修復(fù)再生和功能恢復(fù)帶來了新的研究思路和方向。
　　研究目的:
　　本研究旨在構(gòu)建攜帶CDNF基因的慢病毒載體，建立由該

4、慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞治療載體，使BMSCs具備穩(wěn)定的表達(dá)分泌CDNF的能力，探討這種細(xì)胞移植療法對脊髓挫傷后的組織形態(tài)和功能修復(fù)的影響，探索CDNF對神經(jīng)纖維再生、局部神經(jīng)炎癥、脊髓損傷微環(huán)境的作用及其機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)部分重點(diǎn)探討CDNF在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中的抗炎作用和對細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用，以及可能涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等分子機(jī)制研究。研究方法
　　本研究由兩部分構(gòu)成:
　　第一部分:構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒plenti-C

5、DNF，將表達(dá)質(zhì)粒與相應(yīng)包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，生產(chǎn)攜帶CDNF基因的重組慢病毒;培養(yǎng)并鑒定BMSCs，建立慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs的方法，通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測慢病毒的轉(zhuǎn)染效率及CDNF的表達(dá)與分泌。制作大鼠脊髓挫傷動物模型，隨機(jī)分為4組:CDNF轉(zhuǎn)染的BMSCs移植組（CDNF-BMSCs組）、空病毒載體對照組（

6、Vehicle-BMSCs組）、脊髓損傷對照組（SCI組）和假手術(shù)組（Sham組）。Sham組僅切除椎板不打擊脊髓。將CDNF轉(zhuǎn)染的BMSCs在脊髓損傷處進(jìn)行細(xì)胞移植，觀察該療法對損傷脊髓微環(huán)境、局部神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)及對脊髓神經(jīng)纖維再生和脊髓功能恢復(fù)的影響。行為功能學(xué)觀察:大鼠后肢運(yùn)動功能BBB評分(Basso, Beattie and Bresnahan scale)和BBB亞組評分(BBB subscore scale)、水平梯行走實(shí)

7、驗(yàn)(horizontal ladder walking)評價(jià)脊髓功能恢復(fù)情況;生物化學(xué)檢測:免疫組織化學(xué)染色觀察BMSCs移植后存活情況，ELISA檢測損傷脊髓處CDNF蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測損傷局部的炎性介質(zhì)mRNA表達(dá)水平;組織形態(tài)學(xué)觀察:應(yīng)用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)逆行追蹤技術(shù)檢測皮質(zhì)脊髓束再生情況;免疫組化法檢測神經(jīng)微絲蛋白(neurofilaments，NFs)的表達(dá)水平變化，

8、觀察神經(jīng)軸突再生情況;透射電鏡觀察脊髓損傷處亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)軸突和髓鞘的再生情況。
　　第二部分:使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為炎癥誘導(dǎo)劑建立體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，Western blot檢測不同濃度的LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥狀態(tài)下CDNF蛋白水平的變化;再設(shè)置不同濃度的CDNF干預(yù)組及對照組，使用ELISA法檢測CDNF對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子水平的影響;通過

9、LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定CDNF對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)效果。為了探索CDNF發(fā)揮以上作用的內(nèi)在機(jī)制，我們還檢測了CDNF對小膠質(zhì)細(xì)胞體外炎癥模型中MAPKs信號通路，包括JNK、P38和ERK1/2等分子信號的影響。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分:首先，流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、ELISA等研究結(jié)果表明成功構(gòu)建了plenti-CDNF慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs用于大鼠脊髓挫傷模型的細(xì)胞移植治療。大鼠后肢運(yùn)動功

10、能評分結(jié)果表明，細(xì)胞移植治療后3周至6周，CDNF-BMSCs移植組脊髓功能恢復(fù)情況顯著優(yōu)于Vehicle-BMSCs組和SCI組。組織學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植治療6周后，CDNF-BMSCs移植組的損傷處脊髓空洞顯著小于SCI組和Vehicle-BMSCs組;免疫組化和脊髓HRP逆行追蹤等結(jié)果顯示，CDNF-BMSCs移植組脊髓神經(jīng)軸突再生情況優(yōu)于SCI組和Vehicle-BMSCs組;電子顯微鏡掃描結(jié)果與此一致，發(fā)現(xiàn)CDNF-BMS

11、Cs移植組脊髓損傷處神經(jīng)軸突再生和髓鞘再生情況優(yōu)于SCI組和Vehicle-BMSCs組;我們還發(fā)現(xiàn)CDNF-BMSCs移植組干細(xì)胞存活率高于Vehicle-BMSCs組，這可能與CDNF抑制損傷局部神經(jīng)炎癥有關(guān)。干細(xì)胞移植后CDNF的局部表達(dá)有效抑制了炎性介質(zhì)的釋放和神經(jīng)炎癥的發(fā)生，改善了脊髓損傷的局部微環(huán)境，促進(jìn)了干細(xì)胞的存活及脊髓損傷的再生修復(fù)。
　　第二部分:我們的研究結(jié)果表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞的體外炎癥模型中，LPS刺激可引

12、起小膠質(zhì)細(xì)胞的CDNF水平上調(diào)。我們在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CDNF能夠顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中炎性介質(zhì)的分泌;LDH細(xì)胞毒性檢測表明CDNF預(yù)處理能夠減輕LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥損傷。為了探討CDNF發(fā)揮其抗炎作用的機(jī)制，我們檢測了CDNF干預(yù)對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中MAPKs(JNK/P38/ERK)信號通路的影響。Western blot結(jié)果顯示CDNF干預(yù)可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中JNK信號磷酸化，說明CDNF可能通過抑制JNK信號通

13、路而抑制細(xì)胞炎癥。此外我們還檢測了同等實(shí)驗(yàn)條件下P38和ERK的磷酸化水平，結(jié)果表明不同濃度的CDNF干預(yù)對LPS誘導(dǎo)的p-P38/P38，p-ERK/ERK水平變化無明顯影響，說明CDNF對細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)不是通過P38或ERK信號通路進(jìn)行的。
　　研究結(jié)論:
　　第一部分:我們發(fā)現(xiàn)CDNF慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs移植能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后的修復(fù)。研究結(jié)果顯示，CDNF-BMSCs組大鼠后肢感覺運(yùn)動功能評分、脊髓損傷修復(fù)、神經(jīng)軸

14、突再生情況顯著優(yōu)于Vehicle-BMSCs組，說明干細(xì)胞移植后CDNF在局部的持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)對損傷后修復(fù)起到了關(guān)鍵作用，降低了炎性介質(zhì)的表達(dá)水平，抑制了脊髓損傷后的局部神經(jīng)炎癥，改善了損傷部位的微環(huán)境，為神經(jīng)修復(fù)和再生提供了有利條件。CDNF慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs移植療法為脊髓損傷提供了新的具有潛力的治療方案。
　　第二部分:在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中，發(fā)現(xiàn)LPS刺激可引起小膠質(zhì)細(xì)胞的CDNF表達(dá)水平上調(diào)，提示CDNF可能