脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞PD-L1基因沉默對(duì)大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建PD-L1基因RNA 干擾慢病毒表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）實(shí)現(xiàn)PD-L1基因沉默；研究肝移植術(shù)前輸注PD-L1基因沉默ADSCs 對(duì)大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的影響及機(jī)制。
　　 方法：設(shè)計(jì)針對(duì)PD-L1的shRNA 序列,應(yīng)用基因重組技術(shù)插入到pFU-GW-iRNA 慢病毒表達(dá)載體，重組病毒質(zhì)粒及其3 種輔助包裝原件載體質(zhì)粒通過(guò)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生的病毒感染ADSCs；利用兩套管吻合技術(shù)行S

2、D 大鼠對(duì)Wistar 大鼠異種原位肝移植模型，將受體Wistar 大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：對(duì)照組（A組），供體組（B組），第三方組（C組），第三方轉(zhuǎn)染組（D組），行肝移植前7天，對(duì)照組輸注1ml PBS，實(shí)驗(yàn)組分別輸注1ml 含有1×107個(gè)供體SD 大鼠ADSCs、第三方SD 大鼠ADSCs和第三方SD 大鼠PD-L1基因RNA 干擾ADSCs的PBS。術(shù)后7天處死大鼠，觀察各組肝功能情況，IL-2和IL-10水平，肝臟病理變

3、化，TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot 檢測(cè)Bcl-2和Bax 蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：通過(guò)測(cè)序證實(shí)PD-L1 干擾序列正確插入pFU-GW-iRNA 載體,成功構(gòu)建PD-L1基因RNAi 慢病毒表達(dá)載體，病毒滴度為5×108TU/ml，在轉(zhuǎn)染后48h，即可在熒光顯微鏡下見(jiàn)明亮的綠色熒光，最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）為20；與A組相比，其它各組大鼠術(shù)后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和白介素2水平明顯降低（P<0

4、.05），D組高于C組；白介素10 明顯升高（P<0.05），D組低于C組；HE 染色顯示，A組大鼠肝組織呈急性重度排斥反應(yīng)，B組、C組大鼠肝組織呈急性輕度排斥反應(yīng)，D組大鼠肝組織呈急性中度排斥反應(yīng)；TUNEL 染色顯示A組大鼠的肝臟組織切片上凋亡細(xì)胞大量存在，而B(niǎo)組和C組相對(duì)較少，D組可見(jiàn)較多凋亡細(xì)胞。Western blot 結(jié)果顯示：A組Bcl-2 蛋白低表達(dá)，B組和C組表達(dá)較高，D組表達(dá)低于C組；A組Bax蛋白高表達(dá)，B組和C組