狼瘡性腎炎PD-L1表達及其基因轉(zhuǎn)染的實驗研究.pdf

1、本文對狼瘡性腎炎PD-L1表達及其基因轉(zhuǎn)染進行了實驗研究。 方法與結(jié)果： 1.首先以免疫組織化學(xué)和原位雜交染色方法觀察了PD-L1-PD-1信號通路在Ⅳ型LN患者腎組織中的表達，并分析PD-L1表達和PD-1表達、小管-間質(zhì)病理損害程度之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅳ型LN的腎小管上皮細胞表達PD-L1及其mRNA較正常腎組織高，PD-1作為PD-L1的受體，表達在PD-L1陽性的腎小管周圍的間質(zhì)淋巴細胞上；PD-L1表達的陽性強

2、度和腎皮質(zhì)小管-間質(zhì)PD-1陽性細胞數(shù)成正相關(guān)，和小管-間質(zhì)病理損害程度呈負相關(guān)，推測在Ⅳ型LN中PD-L1-PD-1表達增強，以抑制淋巴細胞的過度激活，維持LN的自身耐受。 2.為進一步在體外明確腎小管上皮細胞表達PD-L1的影響因素及其與T細胞的相互作用，以RT-PCR、FACS、免疫細胞化學(xué)染色方法觀察了人IFN-γ對體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞株HK2細胞表達PD-L1的影響，以及PD-1在人T淋巴細胞株Jurkat細

3、胞上的表達，并通過二者共培養(yǎng)，以ELISA方法觀察Jurkat細胞分泌IL-2的變化，以及抗人PD-L1抗體的阻斷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的HK2細胞表達少量PD-L1，IFN-γ可促進HK2細胞表達PD-L1，并有時間和劑量的依賴性。TPA誘導(dǎo)Jurkat細胞表達PD-1。在HK2細胞與Jurkat細胞共培養(yǎng)之前，先用小鼠抗人PD-L1單克隆抗體與IFN-γ刺激的HK2細胞共孵育，則共培養(yǎng)上清中IL-2含量較無抗體阻斷的共培養(yǎng)上清中IL-2

4、含量明顯升高，說明PD-L1通過與PD-1的結(jié)合負調(diào)節(jié)Jurkat細胞的活性。增強腎小管上皮細胞PD-L1的表達可能有助于改善小管-間質(zhì)的損傷。 3.在完成以上兩部分實驗之后，利用同源重組將PD-L1基因融合到Ⅴ型腺病毒載體基因組中，再通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的pAdeasy-PD-L1-EGFP重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，包裝成腺病毒，篩選能產(chǎn)生高滴度重組腺病毒的293細胞，并對其進行了PCR、Western-blot、活性

5、和安全性等檢測。結(jié)果表明成功構(gòu)建了腺病毒質(zhì)粒pAdeasy-PD-L1-EGFP；經(jīng)酶切和測序鑒定，腺病毒重組基因組中不僅有目的基因PD-L1，而且可正常表達PD-L1，是具有完整功能和感染能力的腺病毒；氯化銫密度梯度離心法純化的pAdeasy-PD-L1-EGFP能抑制小鼠混合淋巴細胞反應(yīng)，而腺病毒空載體AdF-EGFP無此作用，說明pAdeasy-PD-L1-EGFP是有活性的；重組腺病毒對非包裝細胞Hela細胞無毒性，說明無野生型

6、病毒的存在，證明了載體的安全性，且符合病毒轉(zhuǎn)染所需要的滴度，為BXSB狼瘡鼠體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。 4.通過尾靜脈注射pAdeasy-PD-L1-EGFP和ICOSL抗體治療8周齡BXSB狼瘡鼠，觀察蛋白尿的發(fā)生率、dsDNA抗體產(chǎn)生和IgG在腎組織的沉積以及腎組織的病理變化。實驗發(fā)現(xiàn)以pAdeasy-PD-L1-EGFP靜脈注射BXSB狼瘡鼠后，PD-L1可有效轉(zhuǎn)染近端腎小管上皮細胞，與PBS組和AdF組比較，pAdeasy-P

7、D-L1-EGFP治療組狼瘡鼠的蛋白尿和dsDNA抗體產(chǎn)生減少，IgG在腎組織沉積減少，腎組織病理損傷減輕。較之pAdeasy-PD-L1-EGFP組，pAdeasy-PD-L1-EGFP+ICOSL抗體聯(lián)合治療組，蛋白尿和dsDNA抗體產(chǎn)生明顯減少，IgG在腎組織沉積減少，同時明顯延緩了腎小球和腎小管-間質(zhì)病理損傷的出現(xiàn)。 結(jié)論： 1.PD-L1-PD-1信號通路在Ⅳ型LN患者腎小管-間質(zhì)中有表達，PD-L1表達強度與

8、小管-間質(zhì)病理損害程度呈負相關(guān)；體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞株HK2細胞在IFN-γ誘導(dǎo)下表達PD-L1增強且負調(diào)節(jié)T細胞的活性。近端腎小管上皮細胞表達的PD-L1有可能通過與小管-間質(zhì)中淋巴細胞上的PD-1結(jié)合，抑制淋巴細胞的活性而減輕腎組織的損傷； 2.BXSB狼瘡鼠體內(nèi)注射重組腺病毒pAdeasy-PD-L1后，PD-L1可有效轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞，并減輕狼瘡鼠的病變；pAdeasy-PD-L1和ICOSL抗體聯(lián)合治療，更