Renalase與狼瘡性腎炎進(jìn)展的初步研究.pdf

1、【目的】：
　　LN是SLE患者最常見，也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，伴有腎臟損傷的SLE患者預(yù)后不佳。LN患者若不積極治療，將進(jìn)展為ESRD?，F(xiàn)有治療藥物存在一定副作用，患者一旦發(fā)生嚴(yán)重感染，死亡率較高。目前仍需尋找有效且不良反應(yīng)較小的LN治療藥物。renalase是FAD相關(guān)的單胺氧化酶，現(xiàn)有的研究已證實(shí)renalase及其小分子活性肽RP220具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及腎臟保護(hù)作用，包括抑制AKI小鼠腎臟MCP-1、TNF-α等炎癥因

2、子表達(dá)，上調(diào)SOD表達(dá)等。前期基礎(chǔ)研究均提示renalase及RP220具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。LN的活動(dòng)及進(jìn)展與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，我們推測renalase和RP220對LN亦可能存在腎臟保護(hù)作用。目前renalase與LN的相關(guān)性和具體作用尚不清楚，因此，本研究擬通過體內(nèi)、體外和臨床研究初步探討：
　　1) renalase相關(guān)活性肽RP220對LN小鼠模型的干預(yù)作用和機(jī)理；
　　2) LN患者renalase水平與腎臟病

3、理類型和病理表現(xiàn)的關(guān)系；
　　3) LN患者renalase水平與疾病活動(dòng)的相關(guān)性。
　　【方法】：
　　1.1）12周齡雌性MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為veh組，RP220干預(yù)組（RP組）和CTX陽性對照組（CTX組）。采用全自動(dòng)生化儀檢測小鼠尿白蛋白/肌酐比值和腎功能，ELISA法檢測血清抗dsDNA抗體滴度，HE染色觀察腎組織損傷情況，免疫熒光對小鼠腎臟IgG和C3染色。Western blotting和real-

4、time PCR檢測腎臟炎癥因子表達(dá)，Western blotting檢測腎臟NLRP3炎癥小體活化情況。2）小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）隨機(jī)分為對照組、RP220干預(yù)組、siRNA沉默組、LPS刺激組、LPS+RP220干預(yù)組、siRNA negative control組、siRNA+LPS組和siRNA negative control+LPS組。Western blotting和real-time PCR檢測巨噬細(xì)胞炎癥因子

5、和MAPK信號通路的表達(dá)情況；
　　2.入選2012年3月至2013年3月于我院就診并經(jīng)腎活檢證實(shí)為LN的患者，同時(shí)納入性別與年齡相匹配的健康對照者。留取空腹血清及腎組織，并記錄臨床、實(shí)驗(yàn)室生化、免疫和病理指標(biāo)。采用ELISA方法檢測血清renalase水平，免疫組化及免疫熒光檢測腎臟renalase的表達(dá)情況。比較血清renalase水平的差異，并根據(jù)病理分型將患者分為增殖型（III型、IV型、III+V型和IV+V型）和V型患

6、者，分析血清renalase水平與患者病理類型和病理表現(xiàn)的關(guān)系；
　　3.橫斷面研究中，入選2012年3月至2013年3月于我院就診并經(jīng)腎活檢證實(shí)為增殖型LN的患者。根據(jù)SLEDAI評分將患者分為活動(dòng)和非活動(dòng)組，比較兩組間臨床指標(biāo)的差異，單因素相關(guān)分析評估患者血清renalase水平與疾病活動(dòng)指標(biāo)24小時(shí)尿蛋白量、抗dsDNA抗體滴度、補(bǔ)體C3和SLEDAI評分等的相關(guān)性；采用受試者工作曲線（ROC）分析血清renalase對疾病

7、活動(dòng)的預(yù)判價(jià)值。同時(shí)進(jìn)行前瞻性研究，入選處于疾病活動(dòng)期且尚未接受免疫抑制治療的活動(dòng)性增殖型LN患者并隨訪6個(gè)月，觀察免疫抑制治療及疾病緩解對患者renalase水平的影響；探討血清renalase與LN患者疾病活動(dòng)的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】：
　　1.1）RP220可明顯緩解LN模型小鼠疾病病情。RP組小鼠血尿素氮、尿白蛋白/肌酐比值和血清抗dsDNA抗體濃度顯著低于veh組。腎臟病理顯示RP組小鼠腎臟病變顯著輕于veh組，未

8、見明顯系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多，小管損傷較輕，未見小管管型形成，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少。免疫熒光結(jié)果顯示RP組小鼠腎臟C3和IgG沉積顯著少于veh組。與veh組相比，RP組小鼠四肢關(guān)節(jié)腔積液及腫脹得到明顯緩解，頜下腺腫大顯著減小。Veh組小鼠腎臟renalase表達(dá)顯著升高，且與巨噬細(xì)胞共定位。2）我們發(fā)現(xiàn)，與veh組相比，RP組小鼠腎臟促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的表達(dá)顯著下調(diào)，NLRP3的蛋白表達(dá)水平也顯著下

9、降。LPS刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)促炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)顯著升高；采用RP220預(yù)處理細(xì)胞能有效抑制LPS引起的促炎癥因子合成增多；使用siRNA沉默細(xì)胞內(nèi)renalase的表達(dá)后，則進(jìn)一步加重LPS所致的促炎癥因子合成增多。western blotting結(jié)果顯示LPS刺激巨噬細(xì)胞后MAPK信號通路被激活，但RP220預(yù)處理對MAPK信號通路的活化和抑制并無顯著影響；
　　2．血清renalase水平在增殖型LN患者中

10、顯著升高，且與病理分型相關(guān)。入選70例LN患者（其中男性3例，平均年齡37.93±13.59歲），35例健康對照。將兩組進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，LN組患者血清renalase水平顯著高于健康對照。在LN患者中，增殖型LN患者59例，占84%；與V型LN患者相比，增殖型LN患者血清renalase水平顯著升高。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清renalase判斷LN患者病理分型為增殖型的曲線下面積為0.780（P=0.016），診斷的敏感度和特異度分

11、別為67.80%和85.71%。單因素相關(guān)分析結(jié)果顯示LN患者血清renalase水平與腎臟病理活動(dòng)性指數(shù)、細(xì)胞性新月體和間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)。免疫組化及免疫熒光染色結(jié)果顯示LN患者腎組織renalase的表達(dá)顯著高于正常對照組，升高的renalase與巨噬細(xì)胞共定位。
　　3. Renalase水平與LN患者疾病活動(dòng)密切相關(guān)。1）入選增殖型LN患者59例，男性患者1例，平均年齡為36.07±13.09歲。其中32例患者SLEDAI

12、評分≥8，為疾病活動(dòng)組，27例患者為疾病非活動(dòng)組?；顒?dòng)組患者血清renalase水平顯著高于非活動(dòng)組；單因素相關(guān)分析結(jié)果顯示，患者血清renalase與24小時(shí)尿蛋白量、血沉、抗dsDNA抗體、SLEDAI評分和rSLEDAI評分呈正相關(guān)；與血漿白蛋白、補(bǔ)體C3呈負(fù)相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清renalase判斷疾病活動(dòng)的曲線下面積為0.906（P<0.001），敏感度和特異度分別為87.5%和89.2%。Logistic多因素回

13、歸分析結(jié)果顯示，血清renalase、補(bǔ)體C3是判斷LN患者疾病活動(dòng)的獨(dú)立影響因素；2）前瞻性研究中，共入選17例活動(dòng)性增殖型LN患者，隨訪6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，17例患者均達(dá)到部分緩解或完全緩解，疾病活動(dòng)度顯著下降，患者血清renalase水平在治療6個(gè)月后也有顯著下降。
　　【結(jié)論】：
　　renalase相關(guān)活性肽RP220可能通過抗炎作用緩解 MRL/lpr小鼠類狼瘡樣疾病病情，減輕腎臟損傷。RP220可能能夠成為LN干預(yù)治