PD-1及其配體在前房相關(guān)免疫偏離中的表達(dá)和功能.pdf

1、眼組織結(jié)構(gòu)的完整性對于維持正常視功能具有重要意義，此種組織結(jié)構(gòu)完整性的維持有賴于多種機(jī)制，其中最重要的機(jī)制之一是眼內(nèi)赦免機(jī)制。有實(shí)驗(yàn)表明，前房是重要的免疫赦免區(qū)，對維持眼內(nèi)免疫微環(huán)境的穩(wěn)定性有重要作用。 雖然諸多研究證明眼-脾軸的完整性、眼部微環(huán)境(如TGF-β、Fas ligand)等對ACAID的誘導(dǎo)具有重要作用，但ACAID誘導(dǎo)外周免疫耐受的機(jī)制仍不完全清楚。目前認(rèn)為對免疫反應(yīng)具有抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulator

2、y T cell,Treg)是維持機(jī)體外周耐受的重要組成部分，而負(fù)性調(diào)節(jié)分子是參與Treg抑制作用的主要因素之一。 綜上所述，ACAID是機(jī)體的重要免疫赦免機(jī)制之一，對于正常視功能的維持具有重要意義；而PD-1:PD-L作為一種免疫抑制通路參與外周耐受的形成與維持，因此我們推測它對ACAID的誘導(dǎo)可能具有重要作用。本課題正是基于上述研究的最新進(jìn)展，在我們以往的研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出來的。本課題首先用卵白蛋白(ovalbumin，OVA

3、)誘導(dǎo)ACAID，建立ACAID的動物模型；其次利用熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)、Western免疫印跡、免疫組織化學(xué)方法、流式細(xì)胞技術(shù)(flow cyctometricanalysis，F(xiàn)CM)等從mRNA和蛋白水平、細(xì)胞數(shù)量、表型等方面檢測ACAID小鼠脾臟和虹膜睫狀體上PD-l及其配體的表達(dá)；最后通

4、過增殖實(shí)驗(yàn)、過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-1inked immunosorbent assays，ELISA)等方法探討了ACAID小鼠脾臟PD-l<'+>細(xì)胞的功能特征，旨在闡明PD-1及其配體與ACAID形成之間的關(guān)系。 本課題的研究主要分為以下三部分： 第一部分ACAID模型的誘導(dǎo)和鑒定 目的：通過前房注射OVA來誘導(dǎo)ACAID，為實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的動物模型。 方法：采用乙醚吸入法麻

5、醉小鼠，在手術(shù)顯微鏡下用玻璃微量注射針將2μlOVA(20mg／m1)溶液注入小鼠前房；前房注射后第7d于小鼠后足墊內(nèi)皮下注射100μl OVA(2.5mg/ml)溶液與等體積弗氏完全佐劑的混懸液，總體積為0.2ml;7d后于小鼠右耳廓皮內(nèi)注射20μl OVA(10mg／ml)溶液，左耳廓皮內(nèi)注射等量無菌磷酸鹽緩沖液，24h后檢測DTH反應(yīng)。 結(jié)論：通過檢測DTH反應(yīng)表明，前房注射OVA抗原100μg可誘導(dǎo)出ACAID，這為以后

6、的實(shí)驗(yàn)研究提供了穩(wěn)定可靠的動物模型。 第二部分PD-1及其配體在ACAID小鼠脾臟和虹膜睫狀體中的表達(dá) 目的：檢測ACAID小鼠脾臟和虹膜睫狀體中PD-1及其配體在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 方法：(1)用Primer express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針，應(yīng)用FQ-PCR檢測各組小鼠脾臟和虹膜睫狀體中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA的表達(dá)。 (2)應(yīng)用化學(xué)發(fā)光Western免疫印跡法

7、檢測各組小鼠脾臟PD-1、PD-L1和PD-L2的蛋白表達(dá)。 (3)用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察各組小鼠虹膜睫狀體中PD-1和PD-L1陽性細(xì)胞的形態(tài)、分布及數(shù)量變化。 (4)取各組小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，F(xiàn)CM方法分析PD-1在CD3<'+>、CD3<'+>CD4<'+>和CD3<'+>CD4<'->T細(xì)胞上的表達(dá)。 結(jié)果 (1)FQ-PCR結(jié)果顯示，在各組小鼠脾臟中均發(fā)現(xiàn)PD-1、

8、PD-Ll和PD-L2mRNA的表達(dá)；在ACAID小鼠中，此三種分子的mRNA表達(dá)顯著增高。 在各組小鼠的虹膜睫狀體中僅有PD-1和PD-Ll mRNA的表達(dá)，沒有檢測到PD-L2mRNA的表達(dá)；PD-1mRNA的表達(dá)在ACAID小鼠中顯著增加，而PD-L1mRNA的表達(dá)在陽性對照組中顯著增加。 (2)Western免疫印跡結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組中于相對分子質(zhì)量為55kDa、43kDa和42kDa區(qū)可見PD-1、PD-L

9、l和PD-L2特異的陽性印跡帶，且三者蛋白的表達(dá)水平均在ACAID組中顯著增高。 (3)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，PD-1和PD-L1陽性細(xì)胞多呈圓形或類橢圓形，主要分布于虹膜根部和瞳孔緣區(qū)，部分細(xì)胞沿虹膜血管排列，PD-1陽性細(xì)胞數(shù)在ACAID小鼠中增加，而PD-L1陽性細(xì)胞數(shù)在陽性對照組中增加。 (4)FCM結(jié)果顯示，在各組小鼠脾臟CD4<'+>、CD4<'->(CD8<'+>)T細(xì)胞中僅有少量的PD-1表達(dá)，P

10、D-1在CD4<'+>T細(xì)胞上的表達(dá)顯著高于其在CD8<'+>T細(xì)胞上的表達(dá)，CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞在ACAID小鼠中的表達(dá)顯著增高。 結(jié)論：在小鼠的虹膜睫狀體中，PD-1在ACAID小鼠中表達(dá)顯著增加，PD-Ll在陽性對照組中表達(dá)增高，PD-L2沒有表達(dá)。在小鼠的脾臟中，PD-1、PD-L1和PD-L2的mRNA和蛋白的表達(dá)在ACAID小鼠中均顯著增加，且PD-1高表達(dá)在CD4<'+>T細(xì)胞上，提示PD-1可能

11、參與了ACAID的誘導(dǎo)。 第三部分 ACAID小鼠脾臟CD4<,+>PD-1<'+>T細(xì)胞的功能特征 目的：探討小鼠脾臟CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞的功能特征，評價(jià)其在ACAID形成中的作用。 方法： (1)應(yīng)用免疫磁珠細(xì)胞分選(magnetic affinity cell sorting，MACS)方法分選各組小鼠脾臟CD4<'->、CD4<'+>PD-1<'+>和CD4<'+>PD-1<'-

12、>T細(xì)胞，在lμg/ml anti-CD3 mAb的刺激下分別培養(yǎng)72h，<'3>[H]-標(biāo)記甲基胸腺嘧啶(<'3>[H]-TdR)法分別檢測CD4<'+>PD-1<'+>和CD4<'+>PD-1T細(xì)胞的增殖情況。將分選后的CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞與CD4<'+>PD-l<'+>T細(xì)胞按照不同比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，分別加入100μg／ml OVA及基礎(chǔ)培養(yǎng)液，<'3>[H]-TdR法測定CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞的增殖

13、情況。 (2)MACS方法分選各組小鼠脾臟CD4<'->和CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞，在100μg／mlOVA的刺激下培養(yǎng)48h，ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-10水平。 (3)將分選后的CD4<'+>PD-1<'+>和CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞分別注入正常BALB／e小鼠尾靜脈，3d后予常規(guī)皮下免疫，7d后檢測DTH反應(yīng)。 (4)制備各組小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)染色的方法

14、分別與anti-CD4、CD25、PD-1和Foxp3 mAb進(jìn)行孵育，F(xiàn)CM分析CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞與CD4<'+>CD25<'+>Treg的關(guān)系。 結(jié)果：(1)在anti-CD3 mAb的刺激下，各組CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞的增殖水平均較低，而各組CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞則具有較強(qiáng)的增殖能力，與CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞比較有顯著性差異。 將CD4<'+>PD-1<'

15、+>T細(xì)胞與CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞按照不同比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，在OVA刺激下，ACAID小鼠CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞對CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞的抑制能力顯著增強(qiáng)，且其抑制活性具有劑量依賴性。 (2)ELISA結(jié)果顯示，ACAID小鼠CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞分泌高水平的IL-10，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (3)過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將ACAID小鼠脾臟CD

16、4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移入正常BALB／c小鼠體內(nèi)后，用OVA誘導(dǎo)的DTH反應(yīng)受到抑制，而用牛血清白蛋白誘導(dǎo)的DTH反應(yīng)沒有被抑制；將CD4<'+>PD-1<'->T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移后不能抑制DTH反應(yīng)，提示ACAID小鼠脾臟CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞能夠抑制抗原特異性的DTH反應(yīng)。 (4)FCM結(jié)果顯示，約有23.8％的CD4<'+>PD-l<'+>T細(xì)胞表達(dá)CD25和Foxp3分子；約有13.3％的CD

17、4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞僅表達(dá)CD25分子；約有57.38％的CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞同時(shí)為CD25<'->Foxp3<'->細(xì)胞；各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論：ACAID小鼠脾臟中CD4<'+>PD-1<'+>T細(xì)胞能夠分泌大量的IL-10、抑制抗原特異性的細(xì)胞增殖和DTH反應(yīng)；CD4<'+>PD-1<,+>T細(xì)胞與CD4<'+>CD25<'+>Treg部分重疊。提示CD4<'+>PD-1