蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)在前房相關(guān)免疫偏離和Behcet病中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分：無標(biāo)記定量技術(shù)篩選前房相關(guān)免疫偏離小鼠脾CD4+T細(xì)胞的差異蛋白 目的：可溶性蛋白抗原注入眼前房后能誘導(dǎo)出一種全身性的免疫耐受，稱為前房相關(guān)免疫偏離(anteriorchamber—associatedimmunedeviationACAID)。ACAID的主要特點為抗原特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed—typehypersensitivity，DTH)受抑制和補體結(jié)合性抗體缺失。如果生物機體內(nèi)產(chǎn)生了對抗原的耐受反

2、應(yīng)，那么機體就不會產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。這可以解釋為什么一部分人不易患葡萄膜炎而其他人易患葡萄膜炎。所以研究ACAID的形成機制，就能為治療葡萄膜炎提供依據(jù)。CD4+T細(xì)胞參與了ACAID的形成，但是這些細(xì)胞內(nèi)有哪些蛋白起作用，知之甚少。無標(biāo)記定量技術(shù)的優(yōu)點是需要的樣本量相對較少(與傳統(tǒng)的雙向電泳相比)，適用于和本實驗一樣標(biāo)本量較少的實驗。本實驗利用這項技術(shù)對CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的蛋白進行相對定量和鑒定，以期找到參與ACAID形成的新蛋白。

3、 方法：用BALB/c鼠誘導(dǎo)ACAID模型。僅OVA足底皮下免疫為陽性組(positivegroup)，無處理小鼠作為正常組。分離小鼠脾CD4+T細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用無標(biāo)記定量技術(shù)對CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的蛋白進行相對定量和鑒定。 結(jié)果：本實驗發(fā)現(xiàn)表達量變化在兩倍以上的蛋白質(zhì)：陽性組和ACAID組對比有43個；正常組和ACAID組對比96個，分別參與了細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞活動如：蛋白質(zhì)合成，三大物質(zhì)代謝，細(xì)胞循環(huán)，DNA復(fù)

4、制，組裝和修復(fù)等。其中和免疫有密切關(guān)系的蛋白有PP2Ac(正常組：ACAID組=6.11)和proflin-1(正常組：ACAID組=8.16)。 結(jié)論：本實驗發(fā)現(xiàn)大量未在ACAID中研究過的蛋白質(zhì)，說明無標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選技術(shù)，可以作為ACAID的一種研究手段。PP2Ac和proflin-1在ACAID行程中可能起重要作用。 第二部分：雙向電泳篩選Vogt—小柳原田綜合征和Behcet病血清的差異

5、蛋白 目的：Vogt—小柳原田綜合征(VKH綜合征)主要表現(xiàn)肉芽腫性全葡萄膜炎，常伴有腦膜刺激征、聽覺障礙、皮膚和毛發(fā)改變等全身性表現(xiàn)。Behcet病(BD)主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的非肉芽腫性葡萄膜炎、口腔潰瘍、皮膚損害、生殖器潰瘍等為特征的多系統(tǒng)炎癥性自身免疫性疾病。這兩種疾病的病因和發(fā)病機制至今仍不清楚。本研究利用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜的方法篩選VKH綜合征和Behcet病患者血清中特異性表達蛋白，為葡萄膜炎發(fā)生機制的研究提供新思路并

6、為其臨床診斷提供新的依據(jù)。 方法：收集8例活動期VKH綜合征患者血清，8例BD患者血清和8例健康人血清，每組按等體積混合為一個樣本。去除其中高豐度的白蛋白和免疫球蛋白，用雙向電泳方法進行蛋白質(zhì)的分離，膠內(nèi)蛋白通過“藍銀”染色法染色，經(jīng)定量比較篩選出在患者和健康人血清雙向電泳圖譜中表達存在顯著差異的蛋白斑點。經(jīng)MALDI—TOF—TOF質(zhì)譜進行鑒定。另收集18例活動期BD病患者、6例靜止期BD病患者、22例活動期VKH綜合征患者和

7、20例健康志愿者的血清用Westernblot和ELISA方法驗證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。 結(jié)果：在VKH綜合征患者血清中未發(fā)現(xiàn)表達量有明顯差異的蛋白，但是BD患者電泳圖譜中的蛋白斑點經(jīng)定量比較共篩選出6個蛋白斑點在患者和健康人血清中表達存在顯著差異。其中4個蛋白斑點經(jīng)MALDI—TOF—TOF質(zhì)譜分析共鑒定出2種蛋白，分別是結(jié)合珠蛋白(Hp)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)，在活動期BD病患者血清中表達量均上調(diào)，Hp和SAA用Weste

8、rnblot方法進行驗證。結(jié)果顯示，Hp在活動期BD病患者血清中的表達顯著高于活動期VKH綜合征患者和健康人，但個體差異較大，表達量平均約高出2倍。SAA在活動期BD病患者血清中表達顯著高于活動期VKH綜合征患者和健康人。我們用ELISA方法對Hp的表達情況作進一步驗證，結(jié)果證明Hp在活動期BD病患者血清中表達顯著高于活動期VKH綜合征患者和健康人。ELISA的結(jié)果與Westernblot的結(jié)果相一致。 結(jié)論：本研究進一步證實雙