慢性心房顫動(dòng)時(shí)心房組織能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、心房顫動(dòng)（房顫）是臨床上最常見的持續(xù)性心律失常，其發(fā)病率隨著年齡的增加而逐步增加，能明顯增加患者病殘率和病死率。心臟機(jī)械活動(dòng)和電活動(dòng)的維持需要持續(xù)的能量代謝供能。房顫的能量代謝研究提示房顫發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在能量代謝的變化，且能量代謝的變化可以影響心房的收縮功能。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能從整體的角度比較細(xì)胞在不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。同重元素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)是目前

2、最前沿的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，能同時(shí)對(duì)最多8個(gè)樣品進(jìn)行定量研究，精確性高、重復(fù)性強(qiáng)。
　　 目的：
　　 本研究項(xiàng)目擬采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，輔助生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)處理方法對(duì)處于竇性心律和慢性房顫時(shí)的風(fēng)濕性心臟病患者的心耳組織中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性和定量的解析，得到竇性心律和慢性房顫時(shí)左、右心耳組織之間的能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜。分析能量代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)及其在慢性房顫發(fā)生和維持中的作用，探討房顫發(fā)生的分子

3、機(jī)制和潛在的治療靶標(biāo)。
　　 方法
　　 1.收集竇律和慢性房顫患者行二尖瓣置換術(shù)時(shí)的右心耳、左心耳組織標(biāo)本，應(yīng)用液氮研磨、裂解、超速離心獲得心耳組織總蛋白。
　　 2.通過(guò)Bradford法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，行1D SDS-PAGE驗(yàn)證裂解液對(duì)心耳組織全蛋白質(zhì)的提取效果并直觀的觀察所萃取的蛋白質(zhì)的分布特點(diǎn)。
　　 3.取四組樣品各l00μg蛋白質(zhì)進(jìn)行胰蛋白酶酶解，分別進(jìn)行不同的iTRAQ試劑標(biāo)記，混合后

4、進(jìn)行2維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，重復(fù)分析鑒定兩次。
　　 4.應(yīng)用ProteinPilot3.0軟件(ABI，USA)進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，設(shè)定相關(guān)參數(shù)后得到正常竇律和慢性房顫時(shí)左、右心耳組織之間的蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜。分析能量代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)及其在慢性房顫發(fā)生和維持中的作用。
　　 5.應(yīng)用Western blotting法來(lái)檢測(cè)竇性心律和慢性房顫時(shí)左右心耳之間細(xì)胞色素c氧化酶亞單位5B的表達(dá)變化，同時(shí)比較iTRA

5、Q標(biāo)記的串聯(lián)質(zhì)譜重復(fù)檢測(cè)結(jié)果，以驗(yàn)證基于iTRAQ技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果
　　 1.應(yīng)用液氮研磨、裂解、超速離心等方法成功獲得心耳組織總蛋白，經(jīng)lD SDS-PAGE證實(shí)裂解液對(duì)心耳組織全蛋白質(zhì)的提取效果良好。
　　 2.對(duì)竇性心律和慢性房顫時(shí)的左右心耳組織成功的進(jìn)行了iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，總共得到792個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。運(yùn)用GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出123

6、個(gè)與能量代謝有密切關(guān)系的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，包括39個(gè)糖類代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)、23個(gè)與脂類分解代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)、49個(gè)參與生物氧化的差異表達(dá)蛋白質(zhì)以及12個(gè)其他能量相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。這些差異蛋白絕大部分是參與能量代謝反應(yīng)的酶。比較得到的細(xì)胞能量代謝差異表達(dá)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不論在竇性心律或是慢性房顫時(shí)，左右心耳之間上述四類蛋白質(zhì)的表達(dá)都存在一些差異。將慢性房顫時(shí)左右心耳與竇性心律時(shí)左右心耳相比時(shí)，上述蛋白質(zhì)的表達(dá)差異更加明顯。

7、r>　　 3.竇性心律和慢性房顫時(shí)左心耳與右心耳相比，糖類、脂類及生物氧化能量代謝相關(guān)酶類和蛋白質(zhì)在數(shù)量和種類上均以下調(diào)趨勢(shì)為主，如電子傳遞黃素蛋白、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP合酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶A連接酶、乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶等。而異戊?；o酶A脫氫酶等少數(shù)參與氨基酸分解代謝和醛類代謝的酶上調(diào)。
　　 4.慢性房顫時(shí)左右心耳與竇性心律時(shí)相比，大部分糖類、脂類及生物氧化能量代謝相關(guān)酶類和蛋白質(zhì)也出現(xiàn)下調(diào)，如電子

8、傳遞黃素蛋白、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP合酶、果糖二磷酸醛縮酶和長(zhǎng)鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶等。除此之外，慢性房顫時(shí)左心耳比竇性心律時(shí)有更多的酶出現(xiàn)下調(diào)。而醛類代謝相關(guān)的酶仍是上調(diào)為主。
　　 5.應(yīng)用Western blot法檢測(cè)竇性心律和慢性房顫時(shí)左右心耳之間細(xì)胞色素c氧化酶亞單位5B的結(jié)果與iTRAQ標(biāo)記的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果基本一致，證實(shí)了基于iTRAQ技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)論
　　 1.i