應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選基質(zhì)小泡礦化相關(guān)蛋白.pdf

1、在骨形成和發(fā)生過程中，成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞通過分泌具有礦化能力的基質(zhì)小泡(MVs)促使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生鈣化。MVs是一種亞顯微結(jié)構(gòu)的(30-400nm)，細(xì)胞外的，膜包被的，并且富含鈣離子和磷酸根離子的小囊泡。MVs起源于細(xì)胞內(nèi)囊泡。細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)載了來自線粒體的大量鈣離子，并與其內(nèi)的磷酸根離子作用生成無定形磷酸鈣。這種運(yùn)載了無定形磷酸鈣的小泡被釋放至細(xì)胞外沉積于膠原纖維中后，就成為“基質(zhì)小泡”。細(xì)胞外基質(zhì)中的MVs繼續(xù)吸收細(xì)胞外鈣離子和酶

2、解產(chǎn)生磷酸根離子，將不成熟的無定形磷酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓牧u基磷灰石晶體(HA)。當(dāng)MVs內(nèi)充滿HA后，針狀的HA晶體便會(huì)刺破MVs的膜，最后沉積于細(xì)胞外基質(zhì)中啟動(dòng)礦化。
　　 MVs在生物礦化啟動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用，主要包括:提供羥基磷灰石成核位點(diǎn)啟動(dòng)生物礦化，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的Pi/PPi比值，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外Ca2+和Pi的穩(wěn)態(tài)，與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用調(diào)控羥基磷灰石晶體的分布和生長(zhǎng)等。MVs的多種功能與其富含的礦化相關(guān)蛋白密不可分。近

3、來，多種礦化能力細(xì)胞分泌的MVs的蛋白質(zhì)組學(xué)已有報(bào)道，但是還沒有研究對(duì)不同礦化階段的MVs的蛋白質(zhì)組學(xué)變化進(jìn)行比較。
　　 Saos-2細(xì)胞屬于人成骨肉瘤細(xì)胞，具有和成骨細(xì)胞一樣的增殖、分化和礦化能力，并且礦化誘導(dǎo)液能加速其分泌并釋放具有礦化能力的MVs。因此Saos-2細(xì)胞是體外研究MVs功能的良好細(xì)胞模型。MVs和exosomes的傳統(tǒng)提取方法為超速離心法。近來研究者提出ExoQuickTM試劑可用于有效提取exosomes

4、。因此，我們嘗試用ExoQuickTM試劑提取礦化和未礦化的Saos-2細(xì)胞分泌的MVs。提取后的物質(zhì)經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查、標(biāo)志抗原檢測(cè)、堿性磷酸酶(ALP)活性分析以及體外形成羥基磷灰石的能力檢測(cè)，確定為基質(zhì)小泡。我們對(duì)兩組礦化程度不同的MVs蛋白質(zhì)組學(xué)用非標(biāo)記定量技術(shù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)與鈣離子相關(guān)的蛋白在礦化的MVs中高表達(dá)，包括19個(gè)鈣結(jié)合蛋白(calcium binding proteins)、4個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(calmodulin

5、binding proteins，CaMBPs)和9個(gè)蛋白參與鈣離子信號(hào)通路(calcium signaling pathway, CaSP)等。
　　 第一章、Saos-2細(xì)胞礦化誘導(dǎo)模型的建立目的:采用抗壞血酸和β-磷酸甘油的礦化誘導(dǎo)液來促進(jìn)Saos-2細(xì)胞成骨分化及礦化，建立細(xì)胞礦化模型。
　　 方法:將細(xì)胞分正常對(duì)照組、礦化誘導(dǎo)組進(jìn)行培養(yǎng):正常對(duì)照組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng);礦化誘導(dǎo)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加50 ug/ml

6、抗壞血酸和7.5mMβ-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。兩組細(xì)胞培養(yǎng)第六天進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)定性和定量檢測(cè)。
　　 結(jié)果:正常對(duì)照組Saos-2細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下能發(fā)生微弱的礦化，顯微鏡視野中只能找到個(gè)別礦化結(jié)節(jié);而經(jīng)誘導(dǎo)處理的Saos-2細(xì)胞產(chǎn)生大量的羥基磷灰石。礦化結(jié)節(jié)定量結(jié)果顯示誘導(dǎo)組產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)是正常對(duì)照組的6倍左右。
　　 討論:本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)礦化誘導(dǎo)的Saos-2細(xì)胞較正常培養(yǎng)的Saos-2細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)的鈣化能力，產(chǎn)

7、生大量羥基磷灰石。說明我們成功構(gòu)建細(xì)胞礦化模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二章、基質(zhì)小泡提取和驗(yàn)證目的:檢驗(yàn)ExoQuickTM試劑方法能否有效提取基質(zhì)小泡。
　　 方法:用ExoQuickTM試劑方法提取正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)培養(yǎng)Saos-2細(xì)胞的細(xì)胞外分泌物。分泌物提取后用電子顯微鏡檢測(cè)其形態(tài)，用p-NPP檢測(cè)其ALP活性檢測(cè)，同時(shí)用western blot的方法檢測(cè)其表面標(biāo)志物CD63、CD9和Hsp70表達(dá)情況

8、。另外，將提取后的物質(zhì)在礦化緩沖溶液中孵育12h，用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)檢測(cè)礦物沉淀的組成，用鈣離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取物在孵育前后的鈣離子的濃度變化。
　　 結(jié)果:采用ExoQuickTM試劑提取正常和誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞分泌的物質(zhì)經(jīng)離心后團(tuán)塊呈乳白色，團(tuán)塊切片后經(jīng)電子顯微觀察發(fā)現(xiàn)來自兩組細(xì)胞的提取物直徑均在30-400nm之間，為膜包被小泡，誘導(dǎo)組的小泡內(nèi)有明顯的高電子密度物質(zhì)且ALP活性明顯高于正常組，兩組小泡均

9、表達(dá)CD63、CD9和Hsp70。經(jīng)礦化緩沖液中孵育12小時(shí)后，礦化組提取的小泡中的鈣離子濃度較孵育前顯著上升且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且孵育后小泡-礦物沉淀的紅外光譜圖與HA標(biāo)準(zhǔn)品相似。
　　 討論:根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物的檢測(cè)和ALP活性情況，數(shù)據(jù)顯示ExoQuickTM試劑提取的物質(zhì)為MVs。Saos-2細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)液刺激后，細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度比未誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞顯著增加，而且分泌的基質(zhì)小泡也具有高的ALP活性和羥基磷灰石晶體沉

10、積。ALP作為MVs和礦化標(biāo)志蛋白，說明來自誘導(dǎo)組和正常組的基質(zhì)小泡在礦化程度上差異明顯，可以作為礦化不同時(shí)期的研究模型。提取后的基質(zhì)小泡在礦化緩沖液中仍能繼續(xù)吸收鈣離子生成羥基磷灰石，說明我們提取操作沒有破壞MVs的完整性。MVs擁有自身的一套特殊蛋白質(zhì)組可以獨(dú)立于細(xì)胞生成羥基磷灰石的能力。因此，通過研究礦化不同階段的MVs蛋白質(zhì)組變化尋找與礦化相關(guān)的蛋白可以豐富我們對(duì)生物礦化的理解。
　　 第三章、MVs非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)

11、分析目的:采用非標(biāo)記定量技術(shù)比較正常組和誘導(dǎo)組基質(zhì)小泡的蛋白質(zhì)組學(xué)差異變化。
　　 方法:采用最新一代的orbitrap質(zhì)譜(Q-exacitve)采集LC-MS/MS數(shù)據(jù)，然后用Maxquant中的Label free算法是對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非標(biāo)記定量計(jì)算。
　　 結(jié)果:本次實(shí)驗(yàn)共鑒定肽段數(shù)11569個(gè)，蛋白質(zhì)數(shù)1961個(gè)，其中2次實(shí)驗(yàn)中共同鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)為756個(gè)。利用Maxquant軟件并結(jié)合Uniprot人蛋

12、白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)并鑒定了明顯差異蛋白255種（比值大于2），其中186種蛋白上調(diào)，69種蛋白下調(diào)。
　　 結(jié)論:本研究首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)礦化和礦化的基質(zhì)小泡進(jìn)行差異蛋白質(zhì)學(xué)研究。
　　 第四章、MVs蛋白表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證目的:對(duì)非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 方法:通過MAS3.0和STRING9.05軟件分別對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分析，信號(hào)通路分析和蛋白相互作用分析。

13、選取4個(gè)鈣結(jié)合蛋白(GRP94，Calnexin，Calregulin，S100A10)以及ALP進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果:表達(dá)差異的蛋白經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，礦化的基質(zhì)小泡中與鈣離子相關(guān)的蛋白高表達(dá)，其中包括鈣離子結(jié)合蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白和鈣離子信號(hào)通路蛋白。Western結(jié)果與非標(biāo)記定量質(zhì)譜結(jié)果一致，ALP和四個(gè)鈣離子結(jié)合蛋白（rp94、Calnexin、Calregulin和S100A10）均在礦化的MVs中高表