重組腺病毒Ad35-anti-PD-1表達(dá)的PD-1抗體增強(qiáng)CTL抗腫瘤功能的研究.pdf

1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)是一類自身主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性的抗原特異性的T細(xì)胞。因其具有有效靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，在腫瘤的個體化治療中占有重要地位。免疫學(xué)家希望通過基礎(chǔ)研究的突破來提高CTL過繼細(xì)胞治療(adoptivecelltherapy，ACT)的臨床療效。幸運(yùn)的是，隨著人們對腫瘤免疫抑制機(jī)制研究的不斷深入，尤

2、其是免疫檢查點(diǎn)(checkpoint)PD-1(programmedcelldeathprotein1)和CTLA4(cytotoxicTLymphocyteAntigen4)的發(fā)現(xiàn)，為提高CTL的療效提供了新思路。PD-1和CTLA4為T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)控蛋白，它們抑制了T細(xì)胞活性，降低了T細(xì)胞抗腫瘤功能。
　　本課題主要研究了PD-1信號阻斷對CTL抗腫瘤功能的影響。首先我們構(gòu)建了攜帶PD-1抗體基因的5/35型重組腺病毒載體A

3、d35-anti-PD-1。
　　然后我們將經(jīng)PCR鑒定正確的4個病毒克隆感染293細(xì)胞，在不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞上清，通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)3號Ad35-anti-PD-1病毒克隆在72小時PD-1抗體的表達(dá)量最高，約600ng/mL。同時Westernbotting證實(shí)了表達(dá)的PD-1抗體包含正確的重鏈(約50kD)和輕鏈（約25kD）。
　　我們選取3號Ad35-anti-PD-1病毒克隆大量表達(dá)PD-1抗體，在72h

4、收集細(xì)胞上清，用ProteinG親和層析方法純化PD-1抗體。考馬斯亮藍(lán)染色證實(shí)了純化出的PD-1抗體擁有較高純度。ELISA實(shí)驗(yàn)表明從100mL細(xì)胞上清中純化出的抗體質(zhì)量約在45μg。經(jīng)濃縮后，濃度為40μg/mL。
　　最后，我們從人的外周血單個核細(xì)胞中分離和培養(yǎng)了DC和T細(xì)胞。用重組腺病毒Ad35-TP53感染DC，再用該DC去致敏初始T細(xì)胞，獲得了TP53特異性的CTL。在CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，我們設(shè)置了加PD-