PD-1-PD-L信號參與慢性乙肝病毒感染特異性CTL功能衰竭的研究.pdf

1、乙型肝炎是嚴重的肝臟感染性疾病。目前全世界慢性HBV感染者已經(jīng)超過4億，乙肝相關(guān)肝硬化和肝癌的死亡率也逐年增加，嚴重威脅著人類健康。由于目前HBV感染后慢性化的確切機制尚不清楚，所以無法制定出行之有效的治療方法和方案。 HBV作為嗜肝性DNA病毒，本身對肝細胞并沒有損害，在清除病毒和造成肝細胞損傷中起關(guān)鍵作用的是CD8+細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)。急性乙肝病毒感染可激發(fā)強烈的多表位特

2、異性CTL應答；但慢性感染時，特異性CTL增殖、細胞因子分泌及細胞毒效應功能均發(fā)生不同程度損傷，與HBV感染持續(xù)不能清除直接相關(guān)，其原因仍待研究。 T細胞的分化、活化及發(fā)揮效應功能除了需要來自TCR的第一信號，還需要來自共刺激分子的輔助調(diào)節(jié)信號。PD-1是CD28家族的共刺激分子，與配體PD-L結(jié)合后可阻斷TCR信號的傳遞。眾多研究表明，PD-1/PD-L共刺激信號通路在T細胞活化、增殖和細胞因子分泌等各個過程中均發(fā)揮重要的負

3、性調(diào)節(jié)作用。2006年，Barber小組的研究工作發(fā)現(xiàn)，在淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)感染小鼠體內(nèi)，功能衰竭的T細胞表達PD-1上調(diào)，阻斷PD-1與其配體之間的相互作用能使衰竭的T細胞恢復活力并顯著降低病毒載量。此后，在HIV，HCV等慢性病毒感染性中也相繼發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1通路與病毒特異性CD8+T細胞功能障礙有關(guān)，該通路在慢性HBV感染中的研究也已初見報道。但是， PD-1/PD-L通路對HBV特異性CTL分化、活化

4、過程的影響目前仍不清楚，而特異性CTL的分化和活化是其發(fā)揮效應功能的基礎(chǔ)。另一方面，PD-1/PD-L通路在HBV的感染的靶器官——肝臟中的表達及其與疾病發(fā)展的關(guān)系仍未見報道。 因此，為更全面地認識PD-1/PD-L共刺激信號通路在乙型肝肝炎病毒慢性感染中對特異性CTL功能的調(diào)節(jié)作用，我們開展了以下研究：首先，利用多色流式細胞儀結(jié)合pentamer技術(shù)檢測了PD-1分子在HBV特異性CTL的表達情況。結(jié)果顯示，慢性乙肝患者HBV

5、特異性CTL表達PD-1百分率顯著增高，顯著高于作為對照的CMV特異性CTL及外周血總CD8+T細胞。而分析PD-1的表達水平與患者血漿病毒載量及性別、年齡和ALT水平之間關(guān)系顯示， PD-1的表達水平與血漿中HBV病毒的載量正相關(guān)，與其他指標無顯著相關(guān)性。以上結(jié)果提示，可能是患者體內(nèi)高載荷的HBV病毒引起了PD-1表達的上調(diào)。 那么PD-1表達的上調(diào)對特異性CTL的分化、活化及多種抗病毒效應功能是否發(fā)生影響呢？結(jié)合表面分化抗原

6、CD27、CD45RA和趨化因子受體CCR7的表達，我們觀察了在T細胞不同分化階段PD-1表達的變化，我們發(fā)現(xiàn)在CTL細胞分化的不同階段，PD-1表達存在顯著差異。CCR7+ CD27+CD45RA+初始CD8+T細胞PD-1表達極少，在遭遇抗原后(CD45RA') PD-1表達上調(diào)。在分化中期CCR7-CD27+CD45RA-T細胞上PD-1表達達到最高。而分化至終末階段的CCR7-CD27-CD45RA+T細胞中，PD-1表達又復下

7、調(diào)。PD-1表達與CTL分化之間存在明顯關(guān)聯(lián)。而慢性乙肝感染患者特異性CTL多集中于分化中后階段，高表達PD-1分子；但作為對照的CMV特異性CTL大多高分化，PD-1表達水平較低的。因此，分化與PD-1表達的差異使HBV特異性CTL可能接收更強的抑制信號。 通過表面活化標志檢測，我們發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者體內(nèi)PD-1+ CTL高表達活化標志CD38和HLA-DR。接著利用胞內(nèi)因子染色法檢測抗病毒效應分子的表達，我們發(fā)現(xiàn)PD-1+特異

8、性CTL胞內(nèi)仍有較高的GrB的表達，但performn表達低下、IFN-γ表達極低。以上表型提示慢性乙肝患者PD-1+特異性CTL雖然高度活化，但實際處于功能受損狀態(tài)。 PD-1/PD-L通路的抑制效應不僅取決于PD-1的表達量，還取決于PD-1與其配體配接的程度，因此慢性HBV感染時PD-L的表達量也至關(guān)重要。于是我們檢測了外周血淋巴和單核細胞中PD-1配體PD- L1和PD-L2的表達。結(jié)果顯示，慢性乙肝患者外周血單核細胞

9、表面PD-L1表達顯著上調(diào)，而T和B淋巴細胞群體表面PD-L1的表達無顯著變化，同時PD-L2在單核和淋巴細胞中的表達也沒有顯著變化。結(jié)合患者臨床信息分析發(fā)現(xiàn)，外周血單核細胞PD-L1的表達量與血漿ALT水平顯著正相關(guān)。這可能提示，在肝臟炎癥增加的同時機體也開始上調(diào)免疫抑制因子以控制炎癥損傷程度。 慢性乙肝感染時單核細胞上調(diào)PD-L1表達是否抑制特異性T細胞的應答？阻斷PD-1/PD-L1通路又是否能夠恢復特異性T細胞的功能？為

10、回答上述問題，我們進行了PD-1/PD-L1通路阻斷實驗：分離慢性乙肝感染患者外周血PBMC進行體外培養(yǎng)，其中加入特異性表位肽刺激特異性CTL發(fā)生活化和增殖，在以上體系中利用PD-L1的阻斷性抗體阻斷PD-1/PD-L通路后觀察特異性CTL增殖和效應功能的變化。結(jié)果顯示，加入阻斷性抗體以后，特異性CTL的增殖能力顯著增強，清除病毒的重要效應因子IFN-γ的分泌能力顯著提高。上述結(jié)果提示，在慢性HBV感染患者外周血中，PD-1/PD-L1

11、通路參與特異性CTL的功能障礙的調(diào)節(jié)，阻斷該通路能使功能受損的特異性CTL的增殖和細胞因子分泌效應功能恢復。 肝臟是HBV特異性感染的靶器官，且有研究表明PD-1/PD-L1通路參與肝內(nèi)T細胞免疫耐受的調(diào)節(jié)。因此，為闡述PD-1/PD-L這一重要的免疫調(diào)節(jié)通路在慢性乙肝感染肝臟的表達及其在疾病進程中的可能作用，我們進行了以下研究：首先，利用免疫組織化學方法檢測了PD-1在慢性乙肝感染患者肝活檢組織中的表達情況。結(jié)果顯示，慢性乙肝

12、感染肝組織中PD-1陽性細胞顯著增加，且PD-1分子主要表達在匯管區(qū)和肝小葉中浸潤單個核細胞上。免疫雙熒光染色實驗提示，PD-1表達在CD4+和CD8+T淋巴細胞以及少量CD20+B淋巴細胞上。這提示，在慢性乙肝感染肝臟中浸潤著大量活化的淋巴細胞，它們表達PD-1分子上調(diào)。 接著我們檢測了PD-1的兩個配體在慢性乙肝感染肝臟中的表達。結(jié)果顯示，PD-L1的表達在HBV慢性感染肝臟中顯著上調(diào)，除了浸潤炎癥細胞以外，Kupffer'

13、s細胞、血竇內(nèi)皮細胞及DC細胞等大量肝臟原位抗原遞呈細胞均上調(diào)PD-L1的表達。而另一個配體PD-L2的表達則沒有顯著變化。比較炎癥損傷程度不同及炎癥細胞浸潤程度不同的肝組織中原位抗原遞呈細胞上PD-L1的表達，我們發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達與肝組織炎癥損傷和炎癥細胞浸潤程度均密切相關(guān)。上述結(jié)果提示，肝組織的炎癥損傷和免疫應答上調(diào)了肝臟原位抗原遞呈細胞表面PD-L1的表達，這可能起到控制免疫反應強度，保護肝組織的作用。因此，PD-1/PD-L