豬程序性死亡因子1的克隆鑒定以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對PD-1-PD-L通路的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬不僅天然免疫應(yīng)答微弱，病毒特異性獲得性免疫應(yīng)答也出現(xiàn)遲且弱。PRRSV感染引起的免疫抑制是造成PRRSV持續(xù)性感染的主要原因。目前對于PRRSV引起的免疫抑制機(jī)理已經(jīng)從病毒和宿主兩方面都進(jìn)行了廣泛的研究，但從宿主效應(yīng)細(xì)胞的角度進(jìn)行的研究比較少。PD-1/PD-L通路主要調(diào)控機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答水

2、平，在許多人類疾病中證實(shí)與免疫逃避和持續(xù)性感染密切相關(guān)。本研究旨在克隆豬的PD-1基因，并研究PRRSV感染后對PD-1/PD-L通路的影響，為進(jìn)一步探討PD-1/PD-L通路與PRRSV的持續(xù)性感染之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 通過同源性搜索在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到了一條與人PD-1分子同源性較高的豬的EST序列。根據(jù)該序列設(shè)計引物，從豬PBMC中經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得了該基因。測序表明，豬PD-1基因長867bp，編碼28

3、8個氨基酸，與人和小鼠PD-1分子的氨基酸序列同源性分別為63％和54％，并且具有相似的分子結(jié)構(gòu)包括信號肽和跨膜區(qū)兩個疏水性區(qū)域和一個胞外區(qū)以及一個胞內(nèi)區(qū)，且一些功能性的氨基酸和基序在三個種屬間非常保守。為了驗(yàn)證豬PD-1能夠與PD-L1結(jié)合，將豬PD-1的完整編碼區(qū)克隆到pcDNA3.1載體中，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用真核表達(dá)的可溶性蛋白PD-L1-Fc與轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行作用，通過流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)克隆的PD-1分子可以與已報道的豬的PD-L

4、1結(jié)合。利用偽型逆轉(zhuǎn)錄病毒將克隆的PD-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)豬PBMC，在體外用抗豬CD3分子的抗體刺激T細(xì)胞增殖時加入PD-L1-Fc融合蛋白，通過流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)一步證實(shí)豬PD-1與PD-L1的相互作用可以抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，說明豬PD-1分子與人和小鼠的PD-1分子一樣是一個具有免疫負(fù)調(diào)控作用的協(xié)同刺激分子。
　　 針對豬PD-1、PD-L1和PD-L2基因序列分別設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針，以系列稀釋的重組質(zhì)粒p

5、MD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR條件優(yōu)化，建立了檢測這三個基因的熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明。建立的方法在1×102-1×108copies/μL模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2在0.99以上，擴(kuò)增效率均高于96％，可檢測至少100 copies的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。對豬PBMC上這三個基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測表明該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可應(yīng)用于臨床樣品的檢測。

6、r>　　 將豬PD-1基因和PD-L1基因的胞外區(qū)分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET32a上進(jìn)行了表達(dá)。豬PD-1的胞外區(qū)以包涵體的形式表達(dá)，而PD-L1的胞外區(qū)為可溶性表達(dá)。將表達(dá)的蛋白純化后免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)獲得了1株針對豬PD-1分子的單抗和2株針對PD-L1分子的單抗，并對這些單抗進(jìn)行了Western blot分析和流式細(xì)胞儀檢測，證實(shí)這些單抗不僅可以識別原核表達(dá)的變性蛋白，也可以識別真核細(xì)胞表

7、面表達(dá)的膜型蛋白。
　　 利用上面建立的檢測方法對PRRSV感染后效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞上PD-1及其配體的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測。首先用PRRSV感染體外培養(yǎng)的原代PAM細(xì)胞，在感染后不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，利用熒光定量RT-PCR方法，以CyPA作為內(nèi)參，比較感染細(xì)胞與正常培養(yǎng)細(xì)胞中PD-L1和PD-L2的表達(dá)變化。結(jié)果表明，PRRSV在感染后24h PD-L1的表達(dá)開始上調(diào)，與正常細(xì)胞相比上調(diào)了2.2倍，至感染后60h，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到6倍

8、左右。但PD-L2的表達(dá)幾乎沒有變化。通過對培養(yǎng)上清中的病毒毒價進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)水平與病毒的復(fù)制水平之間呈正相關(guān)，說明PRRSV感染可以引起PD-1的配體PD-L1的表達(dá)量增加。然后用PRRSV感染40日齡仔豬，在感染后不同時間點(diǎn)采集PBMC，對PD-1的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測。檢測方法為相對熒光定量RT-PCR（以CyPA作為內(nèi)參）和流式細(xì)胞術(shù)。利用熒光定量RT-PCR檢測的結(jié)果表明，PRRSV感染豬PBMC中PD-1的表達(dá)在

9、感染后3天就開始上調(diào)，與對照豬相比上調(diào)了約3倍，在感染后7-10天達(dá)到高峰，上調(diào)倍數(shù)約5倍左右。通過流式細(xì)胞儀檢測PD-1的表達(dá)變化與熒光定量RT-PCR結(jié)果一致，在感染后7-14天，感染豬PBMC中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)與對照豬相比都上調(diào)了2-3倍，至感染后35天，少數(shù)存活豬PD-1表達(dá)水平仍較高。利用熒光定量PCR檢測方法對血漿中病毒載量進(jìn)行了檢測。通過將病毒載量與PD-1表達(dá)水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，二者之間呈正相