PD-1-PD-L1信號(hào)通路對(duì)小鼠脊髓損傷修復(fù)的影響.pdf

1、由于血-脊髓屏障的存在，正常情況下免疫細(xì)胞無法與脊髓神經(jīng)組織接觸，從而使脊髓呈―免疫豁免‖狀態(tài)。然而脊髓損傷發(fā)生后，則打破這種―免疫豁免‖狀態(tài)。在脊髓損傷早期，脊髓固有免疫系統(tǒng)被激活，包括早期浸潤(rùn)的單核細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，形成巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞群。由于脊髓損傷造成的屏障系統(tǒng)的破壞，使得脊髓神經(jīng)系統(tǒng)抗原通過血液和淋巴到達(dá)淋巴器官；此外，浸潤(rùn)到脊髓損傷區(qū)的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞將抗原遞呈給淋巴細(xì)胞，激活針對(duì)脊髓神經(jīng)組織的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。免疫系統(tǒng)

2、針對(duì)脊髓神經(jīng)組織形成特有的免疫炎癥反應(yīng)，參與脊髓損傷后內(nèi)環(huán)境的構(gòu)成，影響脊髓損傷的預(yù)后。
　　PD-1/PD-L1是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要的免疫負(fù)調(diào)控信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性參與機(jī)體免疫耐受。然而該信號(hào)通路是否參與脊髓損傷后的免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，目前依然是空白。因此本碩士研究課題通過建立PD-L1高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，以及PD-1基因敲除小鼠，對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路在脊髓損傷后的作用做了初步的探討。
　

3、　實(shí)驗(yàn)共分兩部分：首先建立PD-L1高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，并觀察其與野生型動(dòng)物在脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的情況；接下來的研究又觀察了PD-1基因敲除動(dòng)物在脊髓損傷之后的情況，分別比較了其與野生型小鼠在脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的情況，并且在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)水平出現(xiàn)差異的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)一步比較了兩種動(dòng)物脊髓損傷區(qū)的面積和CD4+T淋巴細(xì)胞及巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞和其兩種亞群的浸潤(rùn)情況。
　　我們成功的構(gòu)建了PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠，并且觀察到PD-L1轉(zhuǎn)基因小

4、鼠較野生型小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟的T、B淋巴細(xì)胞和外周組織內(nèi)均明顯高表達(dá)PD-L1分子，另外觀察到PD-L1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與野生型動(dòng)物的主要臟器尺寸和重量以及日常行為方式和野生型小鼠相比均無明顯差異。通過研究發(fā)現(xiàn)PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠在脊髓損傷后期運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況明顯好于野生型小鼠，而且在脊髓損傷21天后出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　在接下來的一部分實(shí)驗(yàn)中，分別制作PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓夾傷的動(dòng)物模型，并且利用B

5、BB評(píng)分量表評(píng)價(jià)兩種動(dòng)物脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)在7天、28天及以后的時(shí)間點(diǎn)兩種動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)水平出現(xiàn)差異，隨后進(jìn)一步研究了PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠在脊髓損傷7天后CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、損傷區(qū)面積和脊髓損傷區(qū)巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-1基因敲除小鼠在脊髓損傷后其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況在脊髓損傷初期較野生型小鼠恢復(fù)差（p<0.01），但隨著脊髓損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，PD-1基因敲除小鼠運(yùn)動(dòng)功能水平

6、逐漸和野生型小鼠相近，繼而在脊髓損傷后14天BBB得分超過野生型小鼠，并且在損傷28天后PD-1基因敲除小鼠運(yùn)動(dòng)功能明顯好于野生型小鼠，并出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。通過分析形態(tài)學(xué)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷7天時(shí)PD-1基因敲除小鼠脊髓的損傷區(qū)范圍較野生型小鼠明顯縮小（P<0.01），也在脊髓損傷早期就有CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到脊髓損傷區(qū)（p<0.05），還發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷早期浸潤(rùn)的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞也較野生型小鼠多，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在PD-1基因

7、敲除小鼠脊髓損傷區(qū)M2型巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量多于野生型小鼠，但M1型巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)的情況則相反，表現(xiàn)出野生型小鼠脊髓損傷區(qū)浸潤(rùn)大量的M1型巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞。綜合分析PD-1基因敲除小鼠、野生型小鼠和PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠BBB評(píng)分結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)水平的平臺(tái)期，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)水平從高到低依次為PD-L1轉(zhuǎn)基因小鼠、PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠。
　　我們初步發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號(hào)通路在小鼠脊髓損傷后對(duì)脊髓損