乙肝患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞乙肝病毒感染狀況的研究.pdf

1、背景： 乙肝是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，全球60億人口中，有超過3.5億人成為乙肝慢性感染者，每年可導(dǎo)致120萬患者死亡。 我國屬于肝炎高發(fā)區(qū)，現(xiàn)患乙肝患者為2800萬，每年大約有50萬以上的患者因HBV感染導(dǎo)致的終末期肝病死亡，嚴(yán)重危害人民身體健康。對(duì)于乙肝的治療，一直缺乏切實(shí)有效的方法，從內(nèi)科綜合處理、抗病毒治療到肝移植手術(shù)治療，都不同程度地存在各種缺陷，難以達(dá)到徹底修復(fù)肝臟細(xì)胞功能，提高預(yù)后，改善生

2、活質(zhì)量，乃至恢復(fù)健康的目的。干細(xì)胞治療是目前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesermhymal stem cells，MSCs)以其取材容易，損傷小且便于自體移植，安全性高，沒有異體排斥反應(yīng)，便于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)調(diào)控，并且在一定條件下經(jīng)體內(nèi)外誘導(dǎo)可定向分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，成為干細(xì)胞在乙肝及各種原因?qū)е碌慕K末期肝病方面的治療應(yīng)用的研究重點(diǎn)之一。 眾多研究表明，許多肝外組織如胰腺、膽管、腎、骨髓等均可檢測到H

3、BV DNA或乙肝免疫標(biāo)志物，而乙肝患者M(jìn)SCs中是否存在HBV感染尚無報(bào)道，本研究將從抗原表達(dá)和病毒核酸表達(dá)兩個(gè)層面了解乙肝患者M(jìn)SCs中乙肝病毒的感染情況，同時(shí)，初步探討在體外以HBV DNA陽性血清培養(yǎng)的情況下MSCs能否被乙肝病毒感染，從而為自體MSCs移植治療乙肝方案的完善提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 1、明確乙肝患者M(jìn)SCs中是否存在HBV感染； 2、初步探討體外培養(yǎng)的條件下，乙肝患者M(jìn)SCs能否被}tBV

4、感染。 材料與方法： 一、標(biāo)本來源 乙肝患者骨髓34份，來源于我科住院病人，年齡27歲-57歲，均為男性，其中，20例患者血清HBV DNA定量陽性(陽性標(biāo)準(zhǔn)為≥1e3拷貝/毫升)，HBV DNA最大值為3.31e7拷貝/毫升。健康人骨髓來源于志愿者。7份用于體外感染的HBVDNA陽性自體血清中，2份HBV DNA為10<'7>拷貝/毫升，5份為10<'5>拷貝/毫升。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、MSCs

5、的分離、培養(yǎng)及鑒定抽取骨髓后以Percoll分離液(Sigma公司，美國)分離MSCs，用Cult-M培養(yǎng)液或患者自體血清培養(yǎng)液接種至25cm<'2>。培養(yǎng)瓶中，均于5﹪CO<,2>濃度下37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長至密度80﹪以上后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)，取P1代細(xì)胞以流式細(xì)胞儀檢測表面分子(CD34、CD44、CD45)。 2、免疫組化法檢測上述兩種方案培養(yǎng)的MSCs的HBsAg、HBcAg表達(dá)3、巢式PCR檢測上述兩

6、種方案培養(yǎng)的MSCs的HBV DNA及cccDNA。 結(jié)果： 一、MSCs的觀察及鑒定 1、觀察：倒置相差顯微鏡下MSCs呈長梭形，體積小，核漿比大，呈均一的成纖維細(xì)胞形態(tài)，可聚集成均勻的集落； 2、鑒定：流式細(xì)胞儀檢測表面分子示P1代乙肝患者M(jìn)SCs中CD34<'->CD44<'+>者比例為93.88﹪，CD44<'+>CD45<'->者比例為98.85﹪，與健康人MSCs一樣，表面分子表達(dá)為CD34<

7、'->CD44<'+>CD45<'->。 二、免疫組化 1、Cult-M培養(yǎng)液培養(yǎng)的乙肝患者M(jìn)SCs HBsAg、HBcAg染色均為陰性； 2、7份HBV DNA陽性自體血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的乙肝患者M(jìn)SCs P1、P3、P5代HBsAg、HBcAg染色亦均為陰性； 三、PCR 陽性對(duì)照首輪PCR產(chǎn)物電泳后可見到280bp條帶，次輪PCR產(chǎn)物電泳后可見到330bp條帶，陰性對(duì)照兩輪PCR均未見到條帶。F

8、BS及HBV DNA陽性自體血清培養(yǎng)的乙肝患者M(jìn)SCs兩輪PCR亦未見條帶。 結(jié)論： 研究結(jié)果顯示，無論患者血清HBV DNA陽性與否以及HBV DNA定量高低，MSCs中HBsAg、HBcAg及HBV DNA均為陰性，這表明乙肝患者體內(nèi)的MSCs尚未受到HBV感染，且這種結(jié)果與乙肝病毒復(fù)制水平的高低無關(guān)。同時(shí)，7份以HBV DNA定量陽性的自體血清培養(yǎng)的乙肝患者M(jìn)SCs P1、P3、P5代細(xì)胞中HBsAg、HBcAg及