前房相關(guān)免疫偏離中CD8+調(diào)節(jié)性T細胞的相關(guān)研究.pdf

1、多種抗原(如可溶性蛋白抗原、病毒編碼的蛋白抗原及次要組織相容性抗原等)被注射入前房后，能誘導出一種全身性的免疫反應(yīng)偏離，稱為前房相關(guān)免疫偏離(anterior chamber associated immune deviation，ACAID)。其特點為抗原特異性的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity,DTH)缺如、細胞毒T細胞前體細胞克隆擴增以及非補體結(jié)合性抗體水平增加。ACAID能保護眼部免受抗

2、原特異性免疫反應(yīng)的損傷。 在ACAID的形成過程中至少存在兩類調(diào)節(jié)性T細胞，一類是抑制DTH反應(yīng)形成的CD4+調(diào)節(jié)性T細胞，另一類是抑制DTH反應(yīng)表達的CD8+調(diào)節(jié)性T細胞。近年來，隨著對調(diào)節(jié)性T細胞研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Foxp3是調(diào)節(jié)性T細胞的特異性的標志分子。但研究大都集中于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，而且Foxp3亦主要表達于CD4+CD25+Tr。最近，研究逐漸發(fā)現(xiàn)在人與嚙齒類動物模型體內(nèi)存在CD8+Tr，并提出F

3、oxp3在其中的表達。 此外，TGF-β1及IL-10是調(diào)節(jié)性T細胞最主要的兩種效應(yīng)性細胞因子。TGF-β對于調(diào)節(jié)性T細胞的誘導形成及其在外周的維持均有重要的作用。以往對于ACAID的研究也發(fā)現(xiàn)這兩類細胞因子是ACAID形成不可缺少的。但是，對于ACAID中CD8+Tr是否通過它們發(fā)揮抑制作用尚不十分清楚。 本課題首先將OVA注射至小鼠眼前房誘導出ACAID動物模型，并用正常小鼠及前房注射PBS的小鼠作為對照，通過局部過

4、繼轉(zhuǎn)移實驗證實了ACAID小鼠脾臟中CD8+T細胞具有抑制功能；其次應(yīng)用FCM及RT-PCR檢測ACAID小鼠脾臟細胞刺激前后CD8+T細胞中Foxp3在蛋白水平和mRNA水平的表達；最后應(yīng)用ELISA分析了ACAID小鼠脾臟中CD8+T細胞分泌TGF-β1及IL-10的水平，并進一步通過抗TGF-β1阻斷抗體證實了這群CD8+Tr以分泌TGF-β1發(fā)揮抑制功能。為進一步闡明ACAID中CD8+Tr的作用機制奠定了基礎(chǔ)。本課題的研究主要

5、分為以下三部分： 第一部分 ACAID模型的建立及ACAID中CD8+T細胞抑制功能的測定。 目的:通過前房注射OVA來誘導ACAID，為實驗研究提供可靠的動物模型。并證實ACAID小鼠脾臟中CD8+T細胞的抑制功能。 方法: (1) 采用乙醚吸入法麻醉C57BL/6小鼠，在手術(shù)顯微鏡下用玻璃微量注射針將5ul OVA(20mg/ml)溶液注入小鼠眼前房；前房注射后第14天于小鼠后足墊內(nèi)皮下注射100u

6、l OVA(2.5mg/ml)溶液與等體積完全弗氏佐劑的混懸液，總體積為0.2ml；7天后于小鼠右耳廓皮內(nèi)注射20ul OVA(20mg/ml)溶液，左耳廓皮內(nèi)注射相同劑量的無菌PBS溶液，24小時后檢測DTH反應(yīng)，以評價ACAID是否形成。 (2)采用局部過繼轉(zhuǎn)移實驗測定CD8+T細胞的抑制功能。磁珠分選ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞，與皮下免疫小鼠的脾臟細胞按1∶1混合重懸于10mg/mlOVA溶液中；取20ul細胞混懸

7、液皮內(nèi)注射至正常小鼠右耳廓內(nèi)，左耳廓皮內(nèi)注射相同劑量的OVA(10mg/ml)溶液，注射前及注射后24小時檢測耳廓腫脹程度。 結(jié)果: (1) DTH檢測結(jié)果顯示，ACAID組小鼠的耳廓腫脹度與陰性對照組相當，較陽性對照組小鼠低，存在非常顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.01)，即ACAID組中DTH反應(yīng)受抑制。 (2)從ACAID小鼠脾細胞中分選出的CD8+T細胞能抑制由皮下免疫小鼠脾細胞作為免疫細胞所引起的小鼠耳廓的

8、腫脹反應(yīng)。其腫脹程度與陰性對照組相當，較陽性對照組低，存在顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.05=。 結(jié)論:通過檢測DTH反應(yīng)表明，前房注射OVA抗原能成功誘導出ACAID；ACAID小鼠脾臟中CD8+T細胞具有抑制功能。這為后續(xù)的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞中Foxp3的表達。 目的:檢測ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞中Foxp3在蛋白和mRNA水平的表達。 方法:使用流

9、式細胞術(shù)(FCM)檢測正常組、ACAID組及前房注射PBS對照(PBS-AC)組各組脾臟細胞未刺激及分別經(jīng)多克隆刺激或抗原特異性刺激后CD8+Foxp3+T細胞的比例；使用RT-PCR分析各組小鼠脾臟cD8+細胞未刺激及分別經(jīng)多克隆刺激和OVA刺激后Foxp3在mRNA水平的表達。 結(jié)果:FCM結(jié)果顯示，ACAID小鼠的脾臟細胞經(jīng)多克隆刺激或特異性刺激后，其中CD8+Foxp3+細胞的比例均增加；而ACAID小鼠脾臟CD8+T細

10、胞中Foxp3 mRNA的表達僅在多克隆刺激后增加。 結(jié)論:在ACAID形成時，脾臟CD8+T細胞表達Foxp3增加，提示cD8+Foxp3+T細胞可能與這一免疫耐受的形成有關(guān)。 第三部分 ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞中細胞因子的分泌及相關(guān)功能的研究 目的:檢測ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞分泌TGF-β1及IL-10的情況，并進一步探討這群CD8+T細胞是否通過分泌TGF-β1或IL-10發(fā)揮抑制功能。

11、 方法:使用ELISA檢測．ACAID中CD8+T細胞分泌TGF-β1及IL-10的水平；在局部過繼轉(zhuǎn)移實驗中使用抗TGF-β1阻斷抗體測定TGF-β1在其中的作用。 結(jié)果:ACAID小鼠脾臟中CD8+T細胞能以抗原特異性的方式分泌TGF-β1；在局部過繼轉(zhuǎn)移實驗中，抗TGF-β1阻斷抗體能阻斷ACAID中傳出性CD8+調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能。 結(jié)論:ACAID中的CD8+調(diào)節(jié)性T細胞通過分泌TGF-β1發(fā)揮其

12、抑制功能。 小結(jié) 本課題研究發(fā)現(xiàn)，將OVA注射至小鼠眼前房能誘導出ACAID；ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞具有抑制功能，在局部過繼轉(zhuǎn)移實驗中能抑制DTH反應(yīng)的表達；ACAID小鼠脾臟細胞在體外經(jīng)多克隆刺激后，其CD8+T細胞上Foxp3的表達在蛋白水平及mRNA水平均增加，而用OVA在體外刺激ACAID小鼠脾臟細胞，其中CD8+T細胞上Foxp3的蛋白水平表達增加；ACAID小鼠脾臟CD8+T細胞能分泌大量的TGF