小鼠B7-H3基因轉染細胞株和單克隆抗體的研制及其對T細胞的共刺激效應.pdf

1、T細胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細胞提供第一信號外，還需要表達于免疫細胞表面一系列共刺激分子提供第二信號。如果缺少第二信號，將會導致T細胞的無反應性或免疫耐受。共刺激分子的協同加強或負性調節(jié)在機體免疫應答的整個過程中起著及其重要的調節(jié)作用。
　　 小鼠B7-H3屬B7超家族新成員。迄今B7-H3的生物學特性和功能研究尚待深入并存在爭議。目前的研究認為，B7-H3在介導T細胞免疫應答中存在2種截然不同

2、的作用：協同刺激或抑制T細胞免疫應答。此外一些研究提出B7-H3分子可以作為腫瘤如肺癌，前列腺癌以及神經母細胞瘤細胞的表面標記分子具有診斷和干預靶向價值。進而鑒于B7-H3受體尚未得到最終確認，這也是B7-H3研究中存在的最大困難。
　　 本研究旨在通過建立小鼠B7-H3基因轉染細胞株，研制特異性單克隆抗體和融合蛋白，從不同角度探討B(tài)7-H3的生物學功能。
　　 本論文分為兩個部分：
　　 一、小鼠B7-H3基因

3、轉染細胞株及其單克隆抗體的研制
　　 1.采用RT-PCR的方法從小鼠骨髓來源的DC中擴增出小鼠B7-H3編碼區(qū)全長基因。經雙酶切后插入真核表達載體pIRES2-EGFP中，構建成重組載體pIRES2-EGFP/B7-H3。通過脂質體法將測序正確的重組載體pIRES2-EGFP/B7-H3轉染293和CHO細胞，G418加壓篩選并經過數次亞克隆。流式細胞術分析顯示B7-H3基因同時轉染的293和CHO細胞膜上能穩(wěn)定高表達小鼠B7

4、-H3分子。為研制小鼠B7-H3單克隆抗體提供了有效的免疫原。2.以轉基因細胞株293/B7-H3為免疫原，免疫SD大鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術，將免疫大鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞。以CHO/B7-H3為陽性篩選細胞，CHO/mock細胞作陰性對照，FCM分析篩選陽性克隆，經過亞克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌大鼠抗小鼠B7-H3單克隆抗體的雜交瘤細胞株（18F9和19F

5、6）。經熒光微球法鑒定，兩株單抗重鏈均為IgG2b，輕鏈為κ鏈。Western blot及流式細胞分析均顯示，兩株單抗都能與B7-H3分子特異性結合，且兩株單抗識別不同的抗原表位。體外長期培養(yǎng)和液氮凍存后，復蘇的雜交瘤細胞生長狀態(tài)良好，穩(wěn)定分泌抗體。研究發(fā)現小鼠B7-H3在B細胞、單核細胞和DC細胞上組成性表達，在靜息和活化的T細胞、NK細胞上不表達。小鼠B7-H3蛋白表達在膀胱上皮細胞胞漿和膜上，而在其他正常組織幾乎都不表達。由此表明

6、，所研制的單克隆抗體能運用于流式熒光標記，免疫印跡及免疫組化，具有重要的應用價值。
　　 二、小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表達及其生物學活性的研究
　　 通過重疊POR技術將小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重鏈Fc恒定區(qū)基因拼接，按照構建B7-H3基因轉染細胞的方法將重組基因轉染CHO細胞，經篩選并獲得CHO/mB7-H3-Fc轉染細胞。該轉基因細胞無血清培養(yǎng)后，收集細胞上清、超濾濃縮后行Protein G柱純化，

7、獲得純品B7-H3-Fc融合蛋白，經Western blot鑒定。通過CCK-8和ELISA方法檢測發(fā)現該融合蛋白對T淋巴細胞的體外增殖和細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌具有明顯的促進作用。在T細胞體外增殖實驗中，單抗的加入可部分阻斷T細胞分泌細胞因子。該融合蛋白識別T細胞上的受體，而與構建的TLT2基因轉染細胞株不結合，提示B7-H3的受體可能不是TLT2分子。同時也表明所研制的單抗具有阻斷功能。
　　 綜上所述，本實驗構建

8、了基因轉染細胞株293/B7-H3和CHO/B7-H3；研制2株特異性大鼠抗小鼠B7-H3功能性單克隆抗體和mB7-H3-Fc融合蛋白基因。該融合蛋白能夠促進T細胞體外增殖及分泌IL-2，IFN-γ。T細胞體外增殖試驗顯示，單抗18F9對B7-H3介導的刺激T細胞分泌細胞因子具有阻斷作用。研究也證實TLT2分子不是小鼠B7-H3的受體。B7-H3作為重要的共刺激分子，在調節(jié)T細胞免疫應答中發(fā)揮了正性共刺激作用?？傊鲜鼋Y果為深入研究B