豬T細(xì)胞表面分子CD3ε單克隆抗體的制備.pdf

1、CD3是豬T細(xì)胞的重要表面分子，由γ、δ、ε、η、ζ五種多肽鏈組成。本研究采用RT-PCR方法從豬外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出CD3ε基因，成功構(gòu)建了表達(dá)豬CD3ε的和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；以原核表達(dá)的CD3ε重組蛋白作為免疫原，利用重組腺病毒和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系篩選到5株分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，為豬傳染病的免疫評價(jià)和致病機(jī)理研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 利用巢式PCR方法從豬外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出包括CD3ε全長基因的641bp

2、基因片段并插入腺病毒穿梭載體構(gòu)建出穿梭質(zhì)粒pDC316-CD3ε，與腺病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后獲得重組腺病毒Adv-CD3ε。該重組腺病毒可在293細(xì)胞中穩(wěn)定傳代，Adv-CD3ε感染的BHK-21細(xì)胞可被CD3ε抗體所識別。將擴(kuò)增出的CD3ε基因片段插入真核表達(dá)載體構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CD3ε，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后用G418進(jìn)行加壓篩選得到穩(wěn)定表達(dá)豬CD3ε的BHK-21細(xì)胞，經(jīng)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后得到穩(wěn)定表達(dá)并可被

3、CD3ε抗體所識別的細(xì)胞系。 利用原核表達(dá)的CD3ε重組蛋白免疫8周齡Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。用基于CD3ε重組蛋白的間接ELISA和構(gòu)建的重組腺病毒與穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)篩選陽性孔。采用有限稀釋法對剛性孔進(jìn)行3次克隆，最終獲得5株穩(wěn)定分泌抗豬CD3ε的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，分別命名為AB、BF、CA、DG、GF。間接ELISA檢測單抗腹水效價(jià)，結(jié)果表明AB、DG、GF的效價(jià)達(dá)1:8