人LIGHT基因轉染細胞的構建及鼠抗人LIGHT單克隆抗體的研制.pdf

1、人LIGHT(TNFSFl4)屬于TNF超家族成員，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，編碼240個氨基酸。原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)人LIGHT定位于19p13．3，與CD27L，4．1BBL，c3相鄰。LIGHT與LTβ和FasL分別有34％和31％的同源性，而且LIGHT與LTαβ異源三聚體結合同一個受體LTBR，與LTα結合同一個受體HVEM，與FasL結合同一個受體DeR3。LIGHT主要表達在活化T細胞和未成熟DC，其mRNA在脾臟細胞、活化的PBL、

2、CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞、粒細胞和單核細胞均有高表達，但不表達于胸腺組織。一些研究結果表明，LIGHT可以促進腫瘤細胞凋亡，也可以促進淋巴細胞細胞活化，這都依賴于靶細胞表達的受體。研究顯示，LIGHT是不依賴于CD28的可誘導型表達的共刺激分子，可有效地協(xié)同CD3信號促進T細胞的增殖，同時它也可以促進DC成熟，提高DC對抗原的提呈能力；體外實驗發(fā)現(xiàn)，可溶性LIGHT分子可使一些惡性腫瘤生長減緩甚至可以誘導細胞凋亡。因此，可溶性和膜型LI

3、GHT與其受體形成的信號網絡在免疫應答和抗腫瘤免疫中有重要的作用。 1人LIGHT基因的克隆 采用RT-PCR的方法，從活化T細胞中克隆得到了人LIGHTcDNA，將其裝入克隆載體pMDl8-T，得重組載體pMDl8-T／LIGHT，酶切、PCR和測序鑒定正確。由此，為人LIGHT基因轉染細胞的構建奠定了物質基礎。 2人LIGHT基因轉染細胞的構建 通過基因克隆技術，將人LIGHT全長的cDNA片段插入逆

4、轉錄病毒載體pEGZ-HA-Term。測序正確后，通過脂質體轉染技術將重組表達載體(pEGZ-HA．Term／LIGHT)與輔助病毒載體共轉染包裝細胞293T，用其培養(yǎng)上清感染L929細胞72h后，經Zeocin篩選出穩(wěn)定表達LIGHT分子的L929細胞株(L929／LIGHT)。經體外長期傳代和液氮反復凍存復蘇，基因轉染細胞生長良好，LIGHT的表達穩(wěn)定在95％以上。 3L929／LIGHT基因轉染細胞對T細胞的共刺激作用

5、 將人外周血T細胞加入包被有抗人CD3激發(fā)型單抗的24孔或96孔板中，絲裂霉素處理的基因轉染細胞L929／LIGHT為刺激細胞，L929／mock為對照細胞，共培養(yǎng)3天。MTT法的分析結果顯示，人CD3激發(fā)型單抗聯(lián)合L929／LIGHT組與實驗對照組相比能顯著地促進T細胞增殖。ELISA法檢測培養(yǎng)上清細胞因子的分泌，結果顯示基因轉染細胞L929／LIGHT能顯著促進人外周血T細胞分泌IFN-γ。 4分泌鼠抗人LIGHT單抗的

6、雜交瘤細胞株的制備 用已建立的基因轉染細胞為免疫原，免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術，將免疫小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓細胞SP2／0進行細胞融合，以上述基因轉染細胞為陽性篩選細胞，以轉質粒的對照細胞L929／mock作為陰性對照細胞，經免疫熒光標記分析及抗體分泌陽性孔內雜交瘤細胞的反復篩選，并經多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得4株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人LIGHT單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2G4、2A11、1F12、1D1

7、l。經快速定性試紙法分析鑒定，2G4重鏈為IgG2a；其它均為IgGl；輕鏈均為K。經體外連續(xù)培養(yǎng)半年以上，液氮凍存后復蘇，細胞的生長狀態(tài)良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。 繼而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成陽性率為95％以上，腹水的產量平均為5．0ml／只小鼠。經ProteinG親和層析柱分離純化，腹水型單抗純化后蛋白含量在0．8～10mg／ml之間。純化后單抗的效價為1：1000以上，抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為

8、0．2～2μg/1×10°細胞。 5鼠抗人LIGHT單克隆抗體對LIGHT膜分子的識別 westemblot方法檢測四株單抗與L929／LIGHT細胞膜上的LIGHT分子結合情況，結果顯示四株單抗均可以在蛋白水平上與LIGHT分子結合。利用已純化的單抗間接免疫熒光法檢測腫瘤細胞株上LIGHT分子的表達，結果表明大部分腫瘤細胞株不表達，而乳腺癌、肺癌的一些細胞株表達LIGHT分子。 6四株抗LIGHT單克隆抗體識別

9、不同的抗原位點 為了檢測四株單抗識別LIGHT分子的表位，分別用生物素標記四株單抗，兩兩比較結合位點的異同。流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)四株單抗識別抗原位點各不相同。這為研究LIGHT的生物學特性和制備LIGHTELISA試制盒奠定了物質基礎。 7T細胞和DCLIGHT分子表達的生物學特性分析 使用己研制的抗人LIGHT單克隆抗體和流式細胞術檢測LIGHT分子在T細胞活化和DC分化過程中的表達顯示，LIGHT在T細胞活

10、化過程中呈暫時性表達，而只有未成熟單核細胞來源的DC(Mo-DC)高表達LIGHT分子，隨著Mo-DC的體外誘導成熟而表達下調。 8兩株單克隆抗體2G4、2All阻斷LIGHT信號介導的協(xié)同刺激作用 在基因轉染細胞協(xié)同激發(fā)型CD3mAb刺激T細胞增殖實驗基礎上，加入2G4、2All單抗，結果顯示這兩株單克隆抗體可部分阻斷T細胞經由基因轉染細胞協(xié)同CD3mAb刺激的增殖。由此提示2G4、2AllmAb可能為阻斷型單克隆抗體