鼠抗人ICOS單克隆抗體的研制及GL50-ICOS信號對T細(xì)胞共刺激作用的研究.pdf

1、ICOS(InducibleCostimulator)及其配體GL50是新近發(fā)現(xiàn)的CD28／B7家族的一對新成員。ICOS主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞上，GL50可持續(xù)表達(dá)在B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面或誘導(dǎo)表達(dá)于成纖維細(xì)胞表面。GL50-ICOS的相互作用，對機(jī)體再次免疫應(yīng)答過程中T細(xì)胞的增殖、活化、分化、細(xì)胞因子的分泌以及B細(xì)胞的增殖、分化、抗體分泌等都發(fā)揮了重要的作用。目前的研究業(yè)已證明：GL50-ICOS信號途徑在機(jī)體炎癥、自身免疫性疾病

2、、腫瘤和移植排斥等免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。對該信號途徑的有效調(diào)節(jié)將不僅為理解人體復(fù)雜、精細(xì)的免疫應(yīng)答系提供新的視角，而且還具有潛在的臨床應(yīng)用前景。因此特異性鼠抗人ICOS單克隆抗體的研制在為研究GL50-ICOS信號途徑生物學(xué)效應(yīng)提供有力的研究工具的同時，也具有潛在的臨床應(yīng)用價值。 一分泌鼠抗人ICOS單抗的雜交瘤細(xì)胞株的制備及其生物學(xué)特性的鑒定 以肺癌病人胸水中高表達(dá)ICOS的活化T細(xì)胞為免疫原，免疫BAL

3、B／c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，將反復(fù)免疫后的小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行細(xì)胞融合，以ICOS-L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為陽性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)空載體的對照細(xì)胞mock-L929作為陰性對照細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記分析及抗體分泌陽性孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞的反復(fù)篩選，并經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得l株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人ICOS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3F8。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，3F8的重鏈為IgGl；而輕鏈為κ。經(jīng)體外連續(xù)傳

4、代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。繼而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成陽性率為95％以上，腹水的產(chǎn)量平均約為5．0ml／只小鼠。經(jīng)ProteinG親和層析柱分離純化，腹水型單抗純化后蛋白含量在0．8~10mg/m1之間。純化后單抗的效價為l：1000以上，抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為0．2-2μg/1×106細(xì)胞。Westernblot分析表明這株單抗均具有良好的識別ICOS分子的能力。競

5、爭結(jié)合實驗進(jìn)行分析，結(jié)果表明3F8mAb與陽性對照抗體識別不同的抗原位點。經(jīng)間接免疫熒光法分析，3F8mAb與誘導(dǎo)活化的外周血T細(xì)胞結(jié)合的陽性率與商品化抗體的結(jié)合陽性率相當(dāng)，提示3F8mAb能很好的識別并結(jié)合活化T細(xì)胞表面的ICOS分子。在人外周血T細(xì)胞用抗人CD3激發(fā)型單抗或聯(lián)合抗CD3和抗CD28單抗激發(fā)的基礎(chǔ)上，加入抗ICOS單抗3F8共培養(yǎng)后，MTT法顯示，與對照組相比，抗ICOS單抗3F8具有明顯的促T細(xì)胞增殖的作用(P<0．

6、05)，并且聯(lián)合抗CD28單抗，促增殖效應(yīng)則更為顯著。ELISA法檢測細(xì)胞因子的分泌發(fā)現(xiàn)，激發(fā)型ICOSmAb3F8介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號可以顯著上調(diào)T細(xì)胞對IL．10的分泌，但對IL-2的分泌影響不大，然而，激發(fā)型CD28mAb主要促進(jìn)T細(xì)胞IL-2的分泌。 二人GL50轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建及GL50．ICOS信號對T細(xì)胞共刺激作用的研究 1．人GL50轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的構(gòu)建 將插入GL50全長cDNA片段的重組表達(dá)載體p

7、EGZ／Term，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)載體與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，用其培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞72h后，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)GL50分子的L929細(xì)胞株(GL50-L929)。經(jīng)體外長期傳代和液氮反復(fù)凍存和復(fù)蘇，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長良好，GL50的表達(dá)穩(wěn)定在95％以上。 2．GL50-ICOS信號對T細(xì)胞共刺激作用的研究 將人外周血T細(xì)胞用抗人CD3激發(fā)型單抗或聯(lián)合抗CD3和抗CD28單抗激發(fā)，加

8、入刺激細(xì)胞GL50-L929或mock-L929共培養(yǎng)4d。MTT細(xì)胞增殖結(jié)果分析顯示，GL50-L929細(xì)胞能有效地促進(jìn)T細(xì)胞增殖，聯(lián)合抗CD28單抗促增殖效應(yīng)則更為顯著。ELISA法檢測培養(yǎng)上清細(xì)胞因子表明，GL50-L929能明顯促進(jìn)T細(xì)胞對IL-10的分泌，對IL-2的分泌影響不大。實驗結(jié)果顯示，特異性鼠抗人ICOS單抗3F8能夠有效阻斷GL50-L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞介導(dǎo)的活化T細(xì)胞的增殖反應(yīng)及細(xì)胞因子的分泌。 綜上所述，