核糖體展示人單鏈抗體庫的構(gòu)建及抗HCV NS5B蛋白的ScFv的篩選.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus）引起的傳染性疾病，主要通過血源途徑傳播，以慢性化程度高為主要特征。全球范圍內(nèi)HCV感染者為1.7～2.0億，我國大約為4000萬。HCV感染后有75～85％的感染者會形成慢性肝炎，進(jìn)一步會發(fā)展為肝硬化和肝癌，目前HCV感染已成為嚴(yán)重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題之一。迄今為止抗HCV的治療僅限于干擾素-利巴韋林聯(lián)合使用，只有約50％的患者可獲得持續(xù)的抗病毒反應(yīng)，而且費(fèi)用昂貴、

2、有一定毒副作用，因此迫切需要研制更加安全有效的新型抗病毒藥物和生物制品。
　　HCVNS5B蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），在病毒RNA復(fù)制中起著關(guān)鍵作用，而細(xì)胞中則沒有相應(yīng)功能的酶類，因此NS5B蛋白是抗HCV的理想靶位。近年來很多學(xué)者針對NS5B蛋白設(shè)計(jì)了多種核苷類與非核苷類抑制劑，療效顯著，然而臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用藥后易出現(xiàn)耐藥突變株，影響了抑制劑的進(jìn)一步應(yīng)用。鑒于NS5B蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確，它在復(fù)制基因組RNA中需

3、要一定的空間構(gòu)型轉(zhuǎn)換才能發(fā)揮酶催化活性，可以克服抑制劑的耐藥現(xiàn)象，因此構(gòu)型抑制劑研究已成為拮抗NS5B酶活性研究的又一重要方向。
　　單鏈抗體（ScFv）基因通過載體攜帶進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)與與抗原特異結(jié)合，調(diào)節(jié)靶分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換與細(xì)胞內(nèi)定位，影響其生物功能的發(fā)揮，可將病毒復(fù)制的關(guān)鍵分子選擇性的“敲除”，從而達(dá)到使目標(biāo)分子生物學(xué)功能失活的目的。本研究從構(gòu)建的核糖體展示人單鏈抗體庫中，篩選出了抗NS5B蛋白的人源化單鏈抗體，有可能抑制NS5B蛋

4、白的空間構(gòu)型轉(zhuǎn)換，為進(jìn)一步研制抗HCV生物制劑帶來了新的希望。
　　【目的】
　　以在HCVRNA復(fù)制中起關(guān)鍵作用的RNA聚合酶NS5B蛋白為靶標(biāo)，從HCV陽性患者的PBLs中提取mRNA并構(gòu)建ScFv基因文庫，利用完全體外篩選、高庫容的核糖體展示技術(shù)來篩選針對NS5B蛋白的人源性ScFv，將初步鑒定篩選到的ScFv生物學(xué)功能。
　　【方法】
　　1.運(yùn)用軟件設(shè)計(jì)引物，以BB7復(fù)制子為模板PCR擴(kuò)增ns5bΔ21

5、基因；克隆入原核表達(dá)載體pRSETA；將重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETA-ns5bΔ21轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析；Western-blot檢測NS5B蛋白的抗原性和特異性；用Ni2+-NTA親和層析柱和電洗脫方法純化NS5B蛋白；用純化的NS5B蛋白免疫小鼠制備多抗血清。
　　2.從6名HCV陽性患者的外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）中提取總RNA，甲醛變性電泳檢測RNA質(zhì)量；以反轉(zhuǎn)錄的全長cDNA為模板PCR擴(kuò)增全

6、套重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）的基因，將VH和VL的膠回收產(chǎn)物拼接，來構(gòu)建核糖體展示的人單鏈抗體（ScFv）基因庫；構(gòu)建ScFv-pMD18T載體，轉(zhuǎn)化后挑60個(gè)克隆提取質(zhì)粒，將酶切鑒定正確的31個(gè)克隆送去測序。
　　3.將純化的NS5B蛋白包被磁珠；ScFvDNA庫在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄與翻譯，形成ScFv-核糖體-mRNA（ARM）三聚體；用包被抗原從三聚體中篩選抗NS5B的ARM；篩選得到的ARM用Tr

7、izol試劑提取RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)；經(jīng)三輪循環(huán)，從ScFv庫中篩選抗NS5B的特異性ScFv基因并對其測序。
　　4.運(yùn)用軟件設(shè)計(jì)引物，以測序正確的Anti-NS5B-ScFv-pMD18T重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增Anti-NS5B-ScFv基因；克隆入原核表達(dá)載體pET16b；將重組表達(dá)質(zhì)粒Anti-NS5B-ScFv-pET16b轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)原核表達(dá)及可溶性分析

8、，SDS-PAGE和Western-blot鑒定ScFv是否有表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.截?cái)嘈虷CVns5b基因克隆、表達(dá)及純化
　　酶切鑒定和序列測定表明成功的構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETA-ns5bΔ21；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析結(jié)果可見新生表達(dá)條帶，Western-blot證實(shí)了其特異性和抗原性均良好；利用親和層析和電洗脫方法獲得了純化的NS5B蛋白；制備了效價(jià)為1:3000的抗血清。

9、　　2.核糖體展示人ScFv庫的構(gòu)建
　　從6名HCV陽性患者的PBLs中提取總RNA，甲醛變性電泳結(jié)果可見28s和18srRNA條帶，表明RNA的質(zhì)量很好；通過重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體的VH和VL基因，并用linker將其拼接，成功構(gòu)建了ScFvDNA文庫；對31個(gè)陽性克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明該文庫有很好的多樣性，庫容量較大，約為7.86×1012。
　　3.篩選針對NS5B的ScFv將ScFvDNA庫體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，通過

10、SDS-PAGE
　　證實(shí)其有效形成了ScFv-核糖體-mRNA三聚體；用包被抗原從三聚體中篩選獲得了針對NS5B的ScFv基因并測序正確。
　　4.抗NS5BScFv的原核表達(dá)及初步鑒定
　　成功構(gòu)建了ScFv-pET16b重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，在大小約為27kD處有新生表達(dá)條帶，Western-blot進(jìn)一步證明了ScFv的特異性。
　　【結(jié)論】