hjagged1^ext-fc融合蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

1、2 7 8· 論著 ·!=!塑胞 王魚(yú)堂圭( C h i nJC e l lM o 1I m m u n o 1 ) 2 0 0 4 ． 2 0 ( 3文章 編號(hào) ： 1 0 0 7— 8 7 3 8 ( 2 0 0 4 ) 0 3— 0 2 7 8— 0 4h J a g g e d l 既 ‘ - F c融合 蛋 白真 核 表達(dá) 載體 的構(gòu) 建和 表 達(dá) 賈洪霞 ，張 萍 ， 周 鵬 ，李軍鋒! ， 韓

2、驊 ，梁英 民 ( 第四軍醫(yī)大學(xué) ：唐都醫(yī)院血液科 ， 陜西 西安 7 1 0 0 3 8 ；基礎(chǔ)部醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室 ， 陜西 西安 7 1 0 0 3 2 )Co n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no faf u s i o np r o t e i nc o n t a i n i n ge x t r a c e l l u l a rd o m a i no fh

3、 u ma nJ a g g e d la n dF cf r a g m e n to fh u m a nI g G1J l AH o n g — x i a t ．Z H A NGP t n g， Z HO UP e n g． L IJ u n ．g，HANHu a，L I A NGY i n g- mi n IDe p a r t me n to fHe ma t o l o g y ， T a n g d uHo s p i

4、t a l ， Xi ’ a l l71 0 0 3 8；De p a r t me n to fM e d i c a lGe n e t i c sa n dDe v e l o p me n t a lBi o l o ~“ ，F(xiàn) o u r t hMi l i t a r yMe d i c a l Un i v e r s i t y ，Xi ’ a n71 0 0 3 2，Ch i n aAb s t r a c tAI

5、M ：T oc on s t r u c tae u k ar y o t i ce x p r es s i onv e c t o rc o n t a i n i n gt h ee x t r a c e l l u l ard o ma i no fh u ma nJ a g g ed lan dFcf r a g me n to fh u ma nI g Glf u s i o ng e n ea n dt oe x p r

6、 e s st h eh J a g g e dle x t _F Cf u s i onp r o t e i ni nma mma l i a nc e l l s ．METHODS：Th ee x ·t r a c el l u l a rd omai no fh u ma nJ ag g e dlg en ewa scl on edf r 0 m n or malh u ma nb on emar r ow c e l

7、 l s ．I no r d e rt oo b t ai nh J a g g e dl e x tF Cf u s i ong e n e， t h ee x t r ac el l ul ardo ma i no fJ a g—g e dlg en ewa si n s e r t e di n t opBl u e s c r i p t - s kf l- h c yl，an dt h e nt h ef u s i o ng

8、e n ewa si n s er t e di n t op EF- BOSn e ot og e tt h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i onv e c t orp EF- BOSn e o - h J a g ge dl 。-F c ．T h er e c o mb i n a t i o np l a s mi dwa st r a n s i e n t l yt r a n s f

9、e c t e di n t oCOS7c e l l sa n dt h ee x pr e s s i o no ft h ef u s i o npr o t e i nwa si d e n t i f i e db yRT - P CR，i mmu n o f l u o r e s c e n ta s s a ya n ds a n d —wi c hE L I S A．RE S I J L T S： Th ee x t

10、r a c e l l u l a rd o ma i no fh u ma nJ a g g e d!g e n ewa s e f e c t i v e l ya mp l i f i e d．Th eDNA s e q u en 。c i n gr e s u ls h o we d t h a tt h ec o n s t r u c t e dp l a s mi dc o n t ai n i n gh J a

11、 g g e dl e x t_ F cf u s i o ng en ewa st h es a mea sd e s i g n e d．Th ef u s i onpr ot e i nwa ss u c c e s f u l l ye x pr e s s e di nma mmal i a nc e l l s ．CONCLUS I ON：Th eh J a g ge dlg en eh a sb e enS U C —c

12、e s s f u l l yc l on e da n de x p r e s e d，whi c hp r o v i de san e w f u -s i 0 np r ot e i nf orf ur t he re x p e r i me n t s．f o re x a mp l e．t h eJ ag —g e dl． F cf u s i o np r ot e i nc a nb eu s e da san e

13、 w s t i mu l a t o rf orp r o l i f e r a t i o no fh e ma t o p o i e t i cs t e r n ／ p r o g e n i t o rc e l l s／ nv i t r o ．收稿 日期 ： 2 0 0 3— 0 7— 1 9 ； 修 回 E t 期 ： 2 0 0 3 — 0 9—1 8基金 項(xiàng) 目 ：國(guó) 家 重 點(diǎn) 基 礎(chǔ) 研 究 發(fā) 展 規(guī) 劃

14、 ( 9 7 3 ) 資 助 項(xiàng) 目( N o ． 0 0 t —C B 5 0 9 9 0 6 ) ；國(guó) 家 自然科 學(xué)基 金資助 項(xiàng) 目( N o ． 3 0 2 0 0 1 4 8 )作者 簡(jiǎn)介 ：賈洪霞 ( 1 9 7 5一) ， 女 ， 山 東德 州人 ， 碩 士生．T e l ： ( 0 2 9 ) 8 3 3 7 4 4 9 0 ； E m a i l ： j h x l 2 1 8 8 3 @ s i n a ． c o

15、 w lC o r r e s p o n d i n ga u t h o r ，E ma i l ： l i a n g ? ' m@ f m mu ． e d u ． C HKe y wo r ds ： h e ma t op oi e t i cs t e r n ／p r o g en i t orc e l l s； Not c h；J ag g e d 1；f u s i o np r o t e i n；eu k

16、 ar y o t i ce x pr e s i o n摘要 目的： 構(gòu)建含人 J a g g e d l胞外段- I g F c融合基 因片段 的質(zhì)粒 ，并在真核細(xì)胞 中表達(dá)。方法 ： 從人骨髓 細(xì)胞 中用 R T ． P C R擴(kuò) 增 h J a g g e d 1 基因的胞外段。經(jīng) D N A測(cè)序后， 將 h J a g g e d l 基因 的胞 外 段 插 入 改 造 過(guò) 的 質(zhì) 粒 p B l u e s c r i p

17、ts kI I中，獲 得 h J a g g e d l· F c 融合基因。將融合基因插入真核表達(dá)載體 p E F ．B O S n e o ， 構(gòu)建真核表達(dá)載體 p E F - B O S n e o - h J a g g e d l‘ - F c 。以其 瞬時(shí) 轉(zhuǎn)染 C O S 7細(xì)胞 ， 應(yīng) 用 R T - P C R、 細(xì)胞 免疫 熒 光技 術(shù) ， 及夾 心 E L I S A檢測(cè)融合蛋 白的表達(dá)。結(jié)果： h J

18、a g g e d l 基 因的胞外 段 被 有 效 地 擴(kuò) 增。 D N A 序 列 分 析 表 明，所 構(gòu) 建 的 含 h J a g g e d l- F c 融合基 因的質(zhì)粒 與設(shè) 計(jì)相 同， h J a g g e d l “ ‘ - F c 融 合蛋白得到正確表達(dá)。結(jié)論 ： 成功地構(gòu)建 了 h J a g g e d l- F c 融 合基因的真核表達(dá)載體 ， 并 在真核細(xì)胞 中正 確表達(dá) ，為進(jìn)一 步研究 J a g g

19、e d l 在造血干／ 祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增奠定 了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞： 造血干／ 祖細(xì)胞 ； N o t c h ； J a g g e d l ； 融合蛋 白； 真核表達(dá) 中圖分 類 號(hào) ： R 3 3 1 ． 2 ； Q 7 8文 獻(xiàn)標(biāo) 識(shí)碼 ： A造 血干細(xì) 胞是 一 群存 在 于造 血 組織 、 具 有 自我 更新 及定 向分 化 潛能 的造 血細(xì) 胞 。 目前 ， 對(duì) 于 造血 干細(xì)胞 的增殖 及分化 的分子調(diào) 節(jié)機(jī)制 尚不完全 清楚

20、 ，可能通 過(guò)細(xì)胞 因子及 細(xì)胞 之 間 的相互 接觸 來(lái)發(fā) 揮 調(diào) 節(jié)作用 ． 2 1 。N o t c h信號(hào)途 徑在生 物進(jìn) 化 中高度 保 守 ， 從果蠅 、 線蟲(chóng)到人 類 ，它廣 泛存 在 于多種 生物 體 內(nèi) ， 主要調(diào)控細(xì)胞 的分 化方 向 ， 與 多種 細(xì)胞 、 組織 、 器 官 的生長(zhǎng)發(fā)育 有關(guān) 引。J a g g e d l 作 為 N o t c h的配體 ，由 12 1 8 個(gè) 氨基酸組成 ， 屬 I 型跨 膜

21、蛋 白。其胞外 段 含有 1 5個(gè) E G F樣重復(fù)序列 ， 并含 1 個(gè)富含半胱 氨酸 的 D S L( D e l t a ． S e r r a t e — L a g 一 2 ) 基 序 ( m o t i f ) ，其 在 與 N o t c h的相互作 用 中起關(guān)鍵 作用 。近來(lái)發(fā) 現(xiàn) ， 在 人造 血干／ 祖 細(xì)胞表面存 在 N o t c h受體 的表 達(dá) ， 而 在骨 髓 基質(zhì) 細(xì)胞 表 面有 J a g g e d

22、l的表 達(dá) ，提 示 N o t c h信號(hào)途徑 可能 在造血干／ 祖 細(xì)胞 的 自我更新 與增殖 中 起重要作 用。近來(lái)有研究 表 明 ， N o t c h信 號(hào)途 徑可抑 制造血 干／ 祖細(xì)胞 的分 化 ，但可 促進(jìn) 其增 殖 川 。本 研究 中 ， 我 們 成功 地構(gòu) 建 了 h J a g g e d l “ ’ 一 F c融合 蛋 白維普資訊 http://www.cqvip.com 2 8 01!Q !=!細(xì)胞與分子免疫

23、學(xué)雜志( C h i nJC e l lM o lI m m u n o 1 ) 2 0 0 4． 2 0( 32 ． 2h J a g g e d l m- F c融合 蛋 白真 核 表達(dá) 載 體 的構(gòu) 建 挑取 含測(cè) 序正確 h J a g g e d l‘ 基 因的克隆 ， 以 E c o RI單酶切后補(bǔ)平 ， 將 目的片段插 入改造 過(guò) 的 p B l u e s c r i p ts kⅡ 中 ， 以 獲 得 h J a g

24、g e d 1一 F c 融 合 基 因 將 h J a g g e d 1一 F c 融合 基 因插 入 p F F — B O S n e o中，建立 真 核表達(dá)載體 p E F — B O S n e o — h J a g g e d l‘ F c 。酶切 所構(gòu) 建 的真核 表達(dá) 載體后 ， 經(jīng) l Og ／ L的瓊脂糖凝 膠 電泳 ( 圖 2 ) 顯示 ， 構(gòu)建 的重組 載體 用 S a cI 和 nI 酶切 可切 出 2 ．

25、 8k b及 8 ． 9k b的兩條 帶 ，同預(yù)期 的結(jié) 果一致 。圖 2 真核表達(dá)載體 p E F — B O S n e o ． h J a g g e d 1‘ 一 F c 的酶切鑒定 F i g2Re s t r i c t ／ o ne n z y med i g e s t i o na n a l y s i so ft h ee u k a r y o t i ce x —p r e s s i o nv e c t o

26、 rp EF — BOS n e o — h J a g g e d l‘ 一 F c1 ：D NAma r k e r ；2：p E F — B OS n e o — h J a g g e d 1一 F cd i g e s t e dw i t hS a cIa u dK o nI ．2 ． 3h J a g g e d l m- F c融合 蛋 白的表 達(dá)及 檢 測(cè) 為 了 在真核細(xì) 胞 中表 達(dá) h J a g g e d l

27、一 F c融合蛋 白，我們 用 p E F — B O S n e o - h J a g g e d ll _ F c 轉(zhuǎn) 染 C O S 7細(xì) 胞 ，并 用 以 下方 法 檢 測(cè) 了 h J a g g e d 1F c融 合 蛋 白 的 表 達(dá) 。 首 先 ， 用 R T - P C R檢測(cè)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞 中 h J a g g e d l【 _ F cm R N A的合 成 。用 p E F - B O S n e o — h J

28、a g g e dl一 F c及 p E F — B O S —n e o 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 C O s 7后 ， 提取細(xì)胞 總 R N A并反轉(zhuǎn) 錄成 c D N A， 再用 h J a g g e d l‘ 基 因的上游 引物及 I g G 1F c基 因的下游引物 ， 進(jìn)行 P C R擴(kuò)增人 h J a g g e d l — F c 融合 基 因。P C R產(chǎn)物經(jīng) l 0g ／ L瓊脂 糖凝 膠 電泳后 ， 結(jié) 果顯 示 ， 轉(zhuǎn)染 p

29、E F - B O S n e o - h J a g g e d ll _ F c的 C O S 7細(xì) 胞 在 約 41 0 0b p處可見(jiàn) 1 條特異性 的條帶 ( 圖 3 ) ， 與預(yù)期 的 h J a g g e d l‘ - F c融合基 因的大小相同。膠 回收 目的 條帶 ， 酶切鑒 定正 確 ( 未顯 示 結(jié)果 ) ； 而 轉(zhuǎn) 染空 載 體 的 C O S 7細(xì)胞 未 出現(xiàn) 此 條 帶 。說(shuō) 明 h J a g g e d

30、 l一 F c基 因組序列 在 m R N A水 平正 確 拼接 。我們進(jìn) 一 步用 直 接免疫 熒 光 檢 測(cè) 了 h J a g g e d l “ I _ F c融 合 蛋 白在 C O S 7細(xì)胞 中的表 達(dá) 。以 F I T C標(biāo)記 的 鼠抗 人 F c抗 體對(duì) 轉(zhuǎn) 染 細(xì)胞進(jìn) 行 染色 ，發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn) 染 p E F — B O S n e o — h J a g g e d le x t —F c的 C O s 7細(xì)胞 染 色

31、 呈 陽(yáng)性 ，陽(yáng)性 物 質(zhì)多 位 于 核周 質(zhì)或 呈簇狀 分 布 ，提示 表達(dá) 的 h J a g g e d l【 _ F c融合 蛋 白多 于 內(nèi)質(zhì) 網(wǎng) 中( 圖 4 ) 。最后 ，我們 用 夾 心 E L I S A檢 測(cè) 了細(xì)胞 培養(yǎng) 上 清 中 h J a g g e d l‘ 一 F c融合 蛋 白的分 泌 表 達(dá) 情 況 。 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) ， 轉(zhuǎn) 染 p E F — B O S n e o —h J a g g e d

32、ll _ F c的 C O S 7 細(xì) 胞 的 培 養(yǎng) 上 清 ，檢 測(cè) 到 h J a g g e d ll _ F c融合蛋 白 的表 達(dá) ；而空 載體 轉(zhuǎn) 染 組 及 正常細(xì)胞培養(yǎng) 上清 中均為 陰性 ( 表 1 ) 。b p2 3 l 3065 5743 6 123 224 l 0 0圖 3h J a g g e d le x [ 一 F c 融合基 因 R T — P C R產(chǎn) 物的瓊脂糖凝膠 電 泳分 析 F i g3An

33、a l y s i so fP CR p r o d u c to fh J a g g e dl — F cf u s i o ng e n eb ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s1 ：DN Ama r k e r ；2 ：CO S 7c e l l st r a n s f e c t e dw i t hp E F — B O S n e o — h J a g g

34、 e d le x t ．F c：3：COS 7c e l l st r a n s f e c t e dwi t hp EF— BOS n e o ．圖 4h J a g g e d l‘ 一 F c 融合蛋白在 C O S 7細(xì)胞中的表達(dá) F i g4E x p r e s s i o no fh J a g g e d l一 F cf u s i o np r o t e i ni nC O S 7c e l l sA：C OS

35、 7c e l l st r a n s f e e t e dw i t hp E F — B O S n e o (×4 O 0)；B：C OS 7c e l l st r a n s f e e t e dw i t hp E F — B O S n e o — h J a g g e d l一 F c (× 2 0 0 ) ．表 1 轉(zhuǎn)染細(xì) 胞培 養(yǎng)上清 中 h J a g g e d l一 F c融合蛋 白

36、表達(dá) 的 E L I S A檢 測(cè) T a b1De t e c t i o no ff u s i o np r o t e i ni nt h ec u l t u r es u p e m a t a n to f t r a n s f e c t e dC OS 7c e l l sb ys a n d wi s hE LI S A ( n=3 ，± s )S o u r c eo fc u l t u r es u

37、 p e r n a t a n tA 4 l 0n mv a l u eF u s i o ng e n e — t r a n s f e c t e dC O S 7c e l l s0 ． 2 6 5±0 ． 0 0 6Emp t yp l a s mi d— t r a n s f e c t e dCOS 7c e l l s0． 0 01±0． 0 01COs 7c e l l s一0． O 0l