hDll1ext-Fc融合蛋白在CHO-S細胞的表達純化與初步鑒定.pdf

1、Notch基因首先在果蠅體內發(fā)現，由于該基因的缺失會導致果蠅翅膀邊緣出現缺口(notch)而得名。Notch信號傳導通路廣泛存在于脊椎與非脊椎動物體內，它是決定細胞命運的重要路徑之一。Notch受體是由胞外區(qū)(extracellularNotch，ECN)和跨膜區(qū)/胞內區(qū)(Notch transmembrane,NTM)兩個亞基組成的異二聚體，二者是通過共價鍵結合在一起的，并具有Ca2+依賴性。哺乳動物中有多重Notch配體，與Delt

2、a高度相似的配體稱為Delta或Delta樣(Delta-like，Dll)，與Serrate相似的稱為Serrate或Jagged。目前發(fā)現人的notch配體共有5種，即Delta-like-1，Delta-like-3，Delta-like-4，Jagged1，Jagged2。作為人重要Notch配體之一的Delta樣配體1是由723個氨基酸組成的單次跨膜蛋白，其中胞外區(qū)含有539個氨基酸，由1個N端保守的DSL(Delta/Ser

3、rate/Lag2)基序和8個表皮生長因子樣重復序列(epidermal growth factor-like repeats，EGF-R)結構域組成，具有重要的生物學活性。該DSL結構域結合Notch受體，促進受體異二聚體分離，進而受體活化激活下游信號，Notch受體經過三次剪切，最終胞內區(qū)釋放到細胞核，激活發(fā)狀分裂相關增強子(hairy and enhancer of split，Hes)等靶基因的轉錄，進而調節(jié)細胞分化和組織發(fā)生。

4、胞內域功能還不太清楚，有研究表明Delta1的胞內區(qū)能夠誘導細胞的生長抑制。
　　近幾年研究表明Notch信號傳導通路與腫瘤發(fā)生有關，如Purow B W等人在2005年發(fā)現Notch1及Notch4配體Delta-like-1、Jagged1在多種神經膠質細胞瘤中過度表達，并且在聯合其他細胞因子的情況下，hDll1胞外區(qū)可以抑制造血干細胞的分化并促進其增殖。魯茁壯等克隆表達了人Notch配體Delta-like-1（hDll1）

5、的胞外區(qū)，并經過集落培養(yǎng)檢測證實其對原始的造血祖細胞具有擴增作用。
　　終上所述，根據已知序列，將合成hDll1ext基因片段經PCR擴增，NheⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接至pIRES2-EGFP-Fc中，取連接產物轉化感受態(tài)細胞，涂于含有kana+抗性的LB固體篩選培養(yǎng)基上，倒置過夜，次日挑選陽性克隆，經菌落PCR驗證正確后測序，將正確的重組質粒轉染至CHO-S細胞，經G418篩選高表達細胞系，利用rProteinA親和柱純化目

6、的蛋白，并通過檢測Notch下游信號分子Hes1的表達及雙熒光素酶報告基因實驗檢測蛋白活性。
　　結果篩選得到了高效表達hDll1ext-Fc的CHO-S細胞株10C7，經WAVE培養(yǎng)密度最高達到6.27×106cells/mL，培養(yǎng)近2周后，細胞大量死亡收得上清體積約1.1L，測定上清中目的蛋白濃度為47.8μg/mL，估計得到總目的蛋白為52.58 mg。將上述上清經rProtein A親和柱純化獲得較高純度的融合蛋白，BCA

7、試劑盒測得蛋白濃度為1.5mg/mL，體積為30mL，最終得到的目的蛋白總量為45mg，可以得到rProtein A親和柱回收率為45mg/52.58mg=85.6％。配合生物活性檢測實驗顯示，可溶性的hDll1ext-Fc能夠激活Hes1報告基因，并且能上調Notch下游分子Hes1的表達，證實其可以激活Notch通路。
　　本實驗通過純化獲得的較高純度的具有生物學活性的hDll1ext-Fc融合蛋白，為后續(xù)研究它的功能奠定了重