CHO細胞表達的重組OCILRP2蛋白的研制.pdf

1、背景
　　 C型凝集素樣受體如NKG2D和CD94/NKG2由于它們共刺激T細胞增殖和細胞因子分泌的能力而被認為是一種新的T細胞刺激分子。C型凝集素家族具有獨特的糖基識別結構域(cysteine rich domain，CRD)，這種糖基識別結構域被稱為C型凝集素樣結構域。
　　 實驗表明，C型凝集素樣分子，包括NK細胞受體CD94/NKG2A和NKG2D，NKRP1家族成員和CD69，在先天和適應性免疫反應中扮演重要角

2、色。通過與其配體相互結合，C型凝集素樣受體能夠在NK細胞和其他細胞中扮演多種角色。C型凝集素受體成員在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能，病原體識別調節(jié)，NK細胞和T細胞的刺激，細胞運輸和骨的形成。
　　 破骨細胞抑制凝集素相關蛋白2(osteoclast inhibitory lectinrelated protein 2，OCILRP2)是破骨細胞抑制凝集素(OCIL)家族的成員之一，屬于Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有較小的胞內區(qū)和跨膜區(qū)，OCI

3、L家族成員的胞外區(qū)均包含一個C型凝集素樣的結構域。OCILRP2是一種新的C型凝集素。小鼠OCILrP2基因位于6號染色體的NK基因復合體內。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3個基因，其胞外區(qū)具有很高的同源性(約80％)。
　　 OCILRP2主要在免疫組織器官中表達，在小鼠脾臟和胸腺中高水平表達，在其他器官如大腦、心臟、肝臟、腎臟、睪丸、肺、胎盤和肌肉等均未檢測到OC

4、ILRP2的表達：其中主要在B細胞和樹突狀細胞(DC)中呈高表達，在未活化的T細胞中幾乎很少表達。但在T細胞被活化后其表達水平明顯上升。初步研究表明，OCILRP2可作為T細胞的共刺激分子，在T細胞的活化過程中發(fā)揮一定作用，且OCILRP2是與其配體NKRP1f相互配合在T細胞的活化過程中發(fā)揮共刺激作用的。
　　 T細胞活化能夠快速誘導OCILRP2的產生，并在72小時內保持相當高的水平。OCILRP2的配體NKRP1f在樹突狀

5、細胞顯著表達?？扇苄缘腛CILRP2-IgFc重組蛋白能夠在體內和體外顯著抑制特異性抗原刺激對T鄉(xiāng)Ⅲ胞的增蚺，白介素2(IL-2)的產生；相反，抗原遞呈細胞表達的NKRP1f通過與OCILRP2共刺激增強B7.1/CD28介導的T細胞的增值。但是有關OCILRP2在T細胞共刺激中的作用機制目前尚不清楚。
　　 目的
　　 探討OCILRP2-IgFc融合蛋白在哺乳動物中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中的穩(wěn)定分泌表達及其表達產物

6、的純化和鑒定，利用純化鑒定后的OCILRP2-IgFc融合蛋白免疫宿主動物制備特異性的抗OCILRP2抗體。
　　 方法
　　 利用脂質體2000為轉染媒介，將OCILRP2-IgFc重組質粒轉染哺乳動物細胞CHO細胞，經G418抗性培養(yǎng)基加壓篩選、克隆化培養(yǎng)、ELISA測定，獲得穩(wěn)定表達OCILRP2-IgFc融合蛋白的細胞克?。?br>　　 穩(wěn)定轉染的CHO細胞在培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，適時更換無血清無動物組織培養(yǎng)基，繼

7、續(xù)培養(yǎng)5-7天后收集培養(yǎng)上清，培養(yǎng)上清經低溫高速離心和0.45微米濾膜過濾后上Protein A柱進行親和層析純化：利用BCA、SDS-PAGE、Western blot、ELISA、質譜分析等方法對純化得到的融合蛋白濃度、純度、分子量、抗原特異性進行測定和鑒定。使用流式細胞術及ELISA等檢測方法對獲得的重組蛋白OCILRP2的生物學活性進行分析。
　　 用純化得到的OCILRP2-IgFc融合蛋白加弗氏完全佐劑(CFA)或不

8、完全佐劑(IFA)乳化免疫雄性的新西蘭白兔制備抗OCILRP2的抗血清，利用飽和硫酸銨(SAS)鹽析和ProteinG親和層析純化獲得特異性抗OCILRP2的多克隆抗體。
　　 結果
　　 建立穩(wěn)定分泌表達OCILRP2-IgFc融合蛋白的CHO細胞系。利用Protein A親和層析純化獲得OCILRP2-IgFc融合蛋白，SDS-PAGE可見兩條蛋白主帶，一條分子量為55kDa，另一條分子量為40kDa，Western

9、 blot可在同樣位置檢測到該兩條蛋白與HRP標記的山羊抗人Ig/Fc抗體特異性結合，將上述兩條蛋白條帶進行質譜分析均含有OCILRP2和標簽Fc的氨基酸序列，證實純化得到的蛋白為OCILRP2-IgFc融合蛋白。制備的OCILRP2-IgFc融合蛋白能有效抑制T細胞增殖、IL-2的分泌、OCILRP2表達等。ELISA、Western blot均證實制備的兔抗OCILRP2抗體與純化得到的融合蛋白OCILRP2-IgFc的兩個主條帶發(fā)