漢族人MBL全長(zhǎng)基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannan-binding Iectin，MBL）屬于哺乳動(dòng)物C型凝集素超家族中膠凝素家族成員，在血清中多以寡聚體形式存在，一般認(rèn)為四聚體以上的高寡聚體才具有生物學(xué)活性。MBL通過(guò)其糖識(shí)別域（carbohydrate-recognition domain，CRD）識(shí)別病原體表面以甘露糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺等為末端糖基的糖結(jié)構(gòu)，業(yè)已證明其能結(jié)合A組乙型鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌，奈氏腦膜炎

2、球菌、肺炎衣原體、甲型流感病毒、HIV、白色念珠菌、小球隱孢子蟲(chóng)等多種病原體，激活凝集素補(bǔ)體途徑并介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用，發(fā)揮抗感染天然免疫效應(yīng)。因此，MBL被認(rèn)為是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別分子之一。 血清MBL水平低下和功能缺陷與多種病原體反復(fù)感染、婦女習(xí)慣性流產(chǎn)、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病相關(guān)，引起MBL缺陷的主要原因是MBL基因的點(diǎn)突變。已發(fā)現(xiàn)，位于MBL結(jié)構(gòu)基因主要的3個(gè)點(diǎn)突變可引起MBL缺陷，它們

3、分別是CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，均位于MBL基因外顯子1，這3個(gè)點(diǎn)突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳，其相應(yīng)的基因型分別為D、B、C型，而野生型為A型。在普通人群中，MBL基因突變的頻率非常高，MBL缺陷成為最常見(jiàn)的免疫缺陷病之一，由此MBL補(bǔ)充治療也呼之欲出。血漿純化的天然MBL補(bǔ)充治療已有文獻(xiàn)報(bào)道，并且已通過(guò)了臨床一期試驗(yàn)，結(jié)果喜人。但存在的問(wèn)題是人血漿中MBL含量極低，提取的成本過(guò)高，來(lái)源受限于血液供應(yīng)，同時(shí)避免不

4、了一般血制品的缺點(diǎn)如潛在的HCV、HIV等病毒污染。此外，應(yīng)用于科研時(shí)由于血液成分復(fù)雜，難于提取高純度MBL，使得對(duì)MBL生物功能的研究難度加大。因此，體外制備大量與天然MBL結(jié)構(gòu)功能相近的重組蛋白意義重大，研究MBL基因表達(dá)的調(diào)控亦顯同樣重要。 本課題組曾克隆了我國(guó)漢族人MBL的cDNA即MBL的編碼序列，并在哺乳細(xì)胞中進(jìn)行了該基因的表達(dá)研究，但表達(dá)效率和所表達(dá)蛋白的寡聚體組分尚欠滿意。鑒于基因內(nèi)含子等非編碼序列對(duì)蛋白表達(dá)有調(diào)

5、節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)嘗試體外表達(dá)MBL全長(zhǎng)基因。 1.漢族人MBL全長(zhǎng)基因的克隆和序列分析; 采用mannan包被以捕獲血清MBL、以抗人MBL抗體（HY13131-11）檢測(cè)的ELISA體系檢測(cè)血清MBL水平。血樣來(lái)自8例無(wú)反復(fù)感染病史和自身免疫病病史的成年健康漢族人個(gè)體，每樣本按1：2、1：4、1：8稀釋，每稀釋度3復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件按兩因素多水平重復(fù)測(cè)量方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出血清MBL水平較

6、高的血樣用于提取白細(xì)胞基因組DNA。以其為模板，設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用Platinum Taq酶進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增MBL全長(zhǎng)基因，并采用用pCR（）-XL-TOPO載體進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建了質(zhì)粒pXL-MBL。小量提取質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR鑒定后送Invitrogen公司測(cè)序。ELISA結(jié)果顯示OD450nm值隨稀釋度的增加而遞減（F=99.351，P<0.001），說(shuō)明檢測(cè)體系是可靠的，不同樣本間OD450nm值有顯著差異（F=27.468，P<

7、0.001）。選擇OD450nm值較高的樣本用于提取白細(xì)胞基因組DNA，擴(kuò)增MBL全長(zhǎng)基因并克隆化。測(cè)序結(jié)果表明，MBL基因反向插入pCR（）-XL-TOPO，全長(zhǎng)6321bp，與GenBank收錄的基因序列（NC_000010.9 Region：54195146～54201466）比較，有17個(gè)堿基不同：其中僅1個(gè)位于編碼區(qū)（外顯子4），即MBL基因的第3195位堿基，導(dǎo)致第126位密碼子改變（CTC→CTG），但它們的編碼產(chǎn)物均為亮

8、氨酸，且該位置堿基恰與GenBank收錄的人MBL cDNA（AH006353）一致；其它不一致的堿基均位于內(nèi)含子或外顯子的非編碼區(qū)。這說(shuō)明我們成功克隆了A型MBL基因全長(zhǎng)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pXL-MBL。 2.MBL基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建; 根據(jù)pXL-MBL、pcDNA3.1（-）和pCI-neo的不同酶切譜，采用不同的內(nèi)切酶，構(gòu)建MBL基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒。 （1）pcDNA3.1（-）-MBL的構(gòu)建：用Kp

9、nⅠ和NotⅠ分別雙酶切載體pcDNA3.1（-）和質(zhì)粒pXL-MBL，凝膠回收載體片段和目的基因片段，用T4 ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌TOP10F’。氨芐青霉素篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌并擴(kuò)大培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒，對(duì)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒予酶切、PCR和測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示A型MBL基因全長(zhǎng)以正向連入載體pcDNA3.1（-），成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-MBL。 （2）pCI-MBL的構(gòu)建：先用MluⅠ和Sma

10、Ⅰ完全酶切質(zhì)粒pXL-MBL，再加入XhoⅠ進(jìn)行不完全酶切，產(chǎn)生的酶切片段有1429 bp、1952 bp、2734 bp、3718 bp、4686 bp、6552 bp、8404 bp等七個(gè)長(zhǎng)度差異較大的DNA片段，其中6552 bp條帶DNA即為含MluⅠ和XhoⅠ酶切粘性末端的MBL全長(zhǎng)基因片段，經(jīng)凝膠電泳切出目的條帶，所回收的DNA片段與用MluⅠ和XhoⅠ雙酶切pCI-neo所獲取的載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，同樣轉(zhuǎn)化宿主菌TOP1

11、0F’。氨芐青霉素篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒予酶切、PCR和測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示A型MBL基因全長(zhǎng)以正向連入載體pCI-neo，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pCI-MBL。 3.pcDNA3.1（-）-MBL在CHO細(xì)胞中的表達(dá); 線性化質(zhì)粒pcDNA3.1（-）-MBL后電穿孔轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，先后用含G418800μg/mL和400μg/mL的完全培養(yǎng)基依次篩選培養(yǎng)9d和12 d。篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞集落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)

12、，行RT-PCR鑒定的同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，采用前述ELISA體系進(jìn)行檢測(cè)，每孔設(shè)3復(fù)孔，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0軟件按one-way ANOVA法和Dunett法多重比較分析各克隆孔與兩倍于陰性對(duì)照組檢測(cè)值之間的差別，高于兩倍陰性對(duì)照值者認(rèn)為陽(yáng)性表達(dá)孔。結(jié)果顯示陽(yáng)性孔分別是E10（P=0.001）、F10（P=0.001）、D8（P<0.001）。選D8進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，上清經(jīng)mannan-Sepharose4B親和層析柱